Le criblage des particules aéroportées concernant la cytotoxicité pulmonaire aiguë en exposant les cellules pulmonaires humaines cultivées à l’ALI utilisant ce système d’exposition in vitro peut aider à réduire des expériences animales. Le principal avantage de ce système d’exposition est le concept de distribution d’aérosols radiaux conduisant à une distribution homogène et à la position des particules sur les cellules. Avant d’ensemencer les cellules, ajouter 2,5 millilitres de milieu de croissance tempéré à chaque puits d’une plaque de six puits.
Placez les inserts de culture cellulaire sans cellules soigneusement à l’intérieur des puits et ajoutez un millilitre de milieu de croissance à chaque insert de culture cellulaire. Incuber les plaques pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après la trypsinisation des cellules, diluer 100 microlitres de la suspension de la culture cellulaire dans une tasse remplie de 10 millilitres de solution isotonique.
Inclinez la tasse lentement sans trembler. Sur un compteur cellulaire, déterminer le nombre de cellules viables par millilitre et la viabilité cellulaire en fonction des paramètres de mesure spécifiques des cellules A549. Après le tempérage de la plaque, aspirer le milieu dans les inserts de culture cellulaire et la graine d’un millilitre de cellules A549 avec une densité de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans chaque insert de culture cellulaire.
Répartir la suspension cellulaire par basculement doux et incuber pendant 24 heures. Réglez le temps de pressage via le contrôle du temps sur le côté avant de la presse. Ouvrez l’alimentation en air comprimé à la valve d’air comprimé.
À l’aide du régulateur de pression sur le côté avant de la presse, réglez la pression de l’air comprimé à environ deux barres. Sortez le tiroir, appuyez sur le bouton Appuyez sur et lisez la pression pressante sur le commutateur de pression numérique. Remplissez le contenant de substance d’une petite quantité de la substance d’essai.
Insérez le piston dans le récipient de substance et tournez-le légèrement d’avant en arrière pour répartir uniformément la poudre dans le récipient. Placez le récipient de substance, avec le piston, dans le tiroir et appuyez sur le bouton Appuyez sur. Ouvrez le tiroir et retirez le piston.
Une étape cruciale est le pressage des substances d’essai qui doivent être spécifiquement comprimées à un gâteau en poudre dans le récipient de substance afin de permettre des expositions stables de particules. Retirez l’adaptateur d’entrée et le réflecteur de condensat du module de guidage des aérosols. Fermez les trois alésages d’alimentation en aérosol dans le module de guidage des aérosols avec des bouchons et les connexions d’alimentation moyenne au module d’échantillonnage avec des volets factices.
Connectez les lignes de vide avec le connecteur à tube du module de guidage des aérosols. Utilisez la roue à main pour fermer le module et mesurer la valeur des contrôleurs de débit. Quelques minutes après la fermeture, les valeurs diminuent en dessous de cinq millilitres par minute.
Démarrez le logiciel générateur d’aérosols. Si le grattoir de substance n’est pas dans la position la plus basse, appuyez sur le bouton Homing Mode. Placez le récipient de substance avec le matériel d’essai pressé à l’envers au-dessus du grattoir de substance.
Assurez-vous que le verre du contenant de substance fait face à l’avant. Placez la plaque de verrouillage dans la fente au-dessus du récipient de substance et serrez la vis noire. Modifiez les valeurs d’alimentation et de rotation vers les paramètres souhaités.
Utilisez les flèches vers le bas pour pousser la glissière avec le récipient de substance jusqu’à ce que le grattoir de substance soit près de la substance pressée. Ouvrez l’alimentation en air comprimé du générateur d’aérosols avec un robinet du contrôleur de débit de masse et démarrez la génération d’aérosols en cliquant sur le bouton Démarrer. Réglez le taux d’alimentation à 15 à 20 millimètres par heure pour éviter de longs temps d’attente.
Contrôlez la bonne génération de particules en observant le nuage de poussière fine avec une petite lampe de poche placée d’en bas derrière le tube de verre de l’élitriateur. Démarrez l’approvisionnement moyen avec le milieu d’exposition préchauffé et remplissez les modules d’échantillonnage jusqu’à ce que les tuyaux d’aval soient couverts pendant que le module est ouvert. Insérez des inserts de culture cellulaire aveugle dans le module d’exposition, pompez le milieu d’exposition jusqu’à ce que les tuyaux inférieurs soient recouverts de milieu et que le côté inférieur des inserts soit en contact avec le milieu.
Démarrez le générateur d’aérosols, fermez le module d’exposition et connectez le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols. 30 minutes après le délai d’avance, sceller la sortie du module d’exposition de l’élitriateur à l’aide d’un bouchon en caoutchouc et retirer les inserts aveugles. Remplissez le milieu d’exposition jusqu’à ce que les tuyaux d’arrêt soient recouverts de milieu.
Retirer les inserts de culture cellulaire des six plaques du puits à l’aide d’une pince à épiler. Versez soigneusement le milieu de croissance de la culture cellulaire en déversant les inserts et utilisez une pipette pour aspirer et jeter le liquide résiduel. Placez les inserts dans les chambres d’exposition des modules d’exposition et d’air pur.
Fermez les modules et commencez les expériences d’exposition en connectant le module d’exposition à la sortie du module d’exposition du générateur d’aérosols et du module d’air pur à l’approvisionnement en gaz du transporteur simultanément. Une fois l’expérience terminée, déconnectez les modules d’exposition et d’air pur et scellez la sortie du module d’exposition. Arrêtez l’alimentation en air comprimé et le générateur d’aérosol en cliquant sur le bouton Stop.
Ouvrez le module d’exposition et d’air pur et utilisez des pinces à épiler pour transférer les inserts de culture cellulaire vers les six plaques de puits préparées après l’incubation. Incuber les six plaques de puits, ainsi que les inserts de culture cellulaire non exposés, pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone à l’interface liquide de l’air. 24 heures après l’exposition, insérez les inserts de culture cellulaire dans les six nouvelles plaques de puits préparées.
Ajoutez un millilitre de la solution WST1 fraîchement préparée à chaque insert de culture cellulaire. Rock les plaques avec soin afin de distribuer la solution de manière homogène sur les cellules. Incuber les six plaques de puits avec les inserts de culture cellulaire pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Après cela, transférer 100 microlitres du surnatant en triplicates de chaque plaque de six puits à une plaque de puits 96. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorption à 450 nanomètres avec une longueur d’onde de référence de 650 nanomètres. Le CULTEX RFS est un système modulaire d’exposition in vitro spécialement conçu qui permet l’exposition directe et homogène des cellules aux particules en suspension dans l’air à l’interface liquide de l’air.
L’exposition des cellules à l’air pur n’entraînent aucune diminution de la viabilité cellulaire au fil du temps. Le système d’exposition a été validé avec succès et établi comme modèle de prévision des risques aigus d’inhalation des composés testés. Exposition des cellules A549 à différentes substances d’essai qui ne présentaient aucune toxicité, moyenne ou forte.
S’il vous plaît assurez-vous que vous gardez strictement les délais qui sont les temps d’incubation, le délai de production de particules, et les temps de dépôt des particules. Cette méthode d’exposition est principalement conçue pour l’exposition aux particules des cellules, mais peut être étendue à l’exposition des aérosols liquides et des gaz en adaptant la méthode de génération d’aérosols. Cette méthode de dépistage permet l’évaluation qualitative des particules inhalables concernant la toxicité aiguë par inhalation in vitro, réduisant ainsi les tests sur les animaux qui fourniraient normalement cette évaluation toxicologique.
N’oubliez pas que travailler avec des substances d’essai toxiques peut être extrêmement dangereux et des précautions, comme le port de gants, d’un masque, doivent toujours être prises lors de la manipulation de ces composés.
