Скрининг частиц, передающихся воздушно-капельным путем, касающихся острой цитотоксичности легких, путем разоблачения культивируемых клеток легких человека в АЛИ с помощью этой системы воздействия in vitro может помочь уменьшить эксперименты на животных. Основным преимуществом этой системы воздействия является концепция распределения радиальных аэрозолей, ведущая к однородной распределению и положению частиц на клетках. Перед посевом клеток добавьте 2,5 миллилитров закаленной среды роста к каждому хорошо из шести хорошо пластины.
Поместите вставки клеточной культуры без клеток тщательно внутри колодцев и добавьте один миллилитр среды роста к каждой вставки культуры клеток. Инкубировать пластины в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа. После трипсинизации клеток разбавьте 100 микролитров подвески клеточной культуры в чашку, наполненную 10 миллилитров изотонического раствора.
Наклоните чашку медленно, не встряхивая. На клеточном счетчике определите количество жизнеспособных клеток на миллилитр и жизнеспособность клеток на основе конкретных параметров измерения клеток A549. После закалки пластины, аспирировать среды в клеточной культуры вставки и семена один миллилитр A549 клеток с плотностью от трех раз от 10 до пятой клетки на миллилитр в каждой клетке культуры вставки.
Распределите подвеску клетки нежным качания и инкубации в течение 24 часов. Установите время нажатия с помощью контроля времени на передней стороне пресса. Откройте сжатый воздух на сжатом воздушном клапане.
Используя регулятор давления на передней стороне пресса, установите давление сжатого воздуха примерно до двух бар. Вытащите ящик, нажмите кнопку «Нажмите» и прочитайте нажатие на выключатель цифрового давления. Заполните контейнер вещества небольшим количеством испытательного вещества.
Вставьте поршень в контейнер вещества и поверните его немного вперед и назад, чтобы равномерно распределить порошок в контейнере. Поместите контейнер с веществом с поршенем в ящик и нажмите кнопку «Нажмите». Откройте ящик и удалите поршень.
Важным шагом является нажатие испытательных веществ, которые должны быть специально сжаты к порошковому торту в контейнере вещества, с тем чтобы обеспечить стабильное воздействие твердых частиц. Удалите адаптер в входе и конденсатный отражатель из аэрозольного направляющий модуль. Закройте три аэрозольные кормовые скважины в аэрозольный направляющий модуль вилками и средними соединениями питания в модуле отбора проб манекенами.
Соедините вакуумные линии с разъемом трубки аэрозольного направляющий модуль. Используйте ручное колесо, чтобы закрыть модуль и измерить значение контроллеров потока. Через пару минут после закрытия значения снижаются ниже пяти миллилитров в минуту.
Запустите программное обеспечение аэрозольного генератора. Если скребок вещества находится не в самом низком положении, нажмите кнопку Режим самонаведения. Поместите контейнер вещества с прессованным испытательным материалом вверх дном над веществом скребок.
Убедитесь, что стекло контейнера вещества выходит на фронт. Поместите запирая пластину в слот над контейнером вещества и затяните черный винт. Измените значения для Feed и Rotation на нужные настройки.
Используйте нисходящие стрелки, чтобы нажать вниз слайд с веществом контейнера, пока вещество скребок находится рядом с нажатой вещества. Откройте подачу сжатого воздуха для аэрозольного генератора одним нажатием контроллера массового потока и начните генерацию аэрозолей, нажав на кнопку «Пуск». Установите скорость подачи до 15 до 20 миллиметров в час, чтобы избежать длительного времени ожидания.
Контролйте правильное генерацию частиц, наблюдая за мелким облаком пыли с помощью небольшого фонарика, расположенного снизу за стеклянной трубкой элютриатора. Запустите средний запас с разогретой средой экспозиции и заполните модули выборки до тех пор, пока не будут покрыты трубы, пока модуль открыт. Вставьте слепые клетки культуры вставки в модуль экспозиции, насос воздействия среды вниз до тех пор, пока даунпайпы покрыты средой и нижней стороне вставки находятся в контакте со средой.
Запустите аэрозольный генератор, закройте модуль экспозиции и подключите модуль экспозиции к выходу модуля экспозиции аэрозольного генератора. Через 30 минут после времени ведения, печать экспозиции модуль розетки элютриатора с резиновой вилкой и удалить слепые вставки. Пополнить среду экспозиции до тех пор, пока выхлопные трубы не будут покрыты средой.
Удалите вставки клеточной культуры из шести пластин хорошо с помощью пинцета. Налейте среды роста тщательно из клеточной культуры вставляет покинуть путем свержения вставки и использовать пипетку, чтобы аспирировать и отказаться от остаточной жидкости. Поместите вставки в камеры экспозиции как экспозиции, так и модулей чистого воздуха.
Закройте модули и начните эксперименты по экспозиции, подключив модуль экспозиции к выходу модуля экспозиции аэрозольного генератора и модуля чистого воздуха к газоснабжения перевозчика одновременно. После завершения эксперимента отключите модули экспозиции и чистого воздуха и запечатав розетку модуля экспозиции. Остановите подачу сжатого воздуха и аэрозольный генератор, нажав на кнопку Stop.
Откройте экспозицию и модуль чистого воздуха и используйте пинцет для передачи вставки культуры клеток в подготовленные после инкубации шесть пластин хорошо. Инкубировать шесть пластин хорошо, а также неэкспонированных клеток культуры вставки, в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в воздухе жидкого интерфейса. Через 24 часа после экспозиции вставьте вставки культуры клеток в новые подготовленные шесть пластин хорошо.
Добавьте один миллилитр свежего готового решения WST1 в каждую вставку культуры клеток. Тщательно раскачивайте пластины, чтобы равномерно распределить раствор по клеткам. Инкубировать шесть пластин хорошо с клеточной культуры вставки в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
После этого перенесите 100 микролитров супернатанта в три пластины с каждой шести хорошо пластины на пластину 96 хорошо. Используя считыватель микропластиц, измерьте абсорбанс на 450 нанометров со эталонной длиной волны 650 нанометров. CULTEX RFS является специально разработанной модульной системой воздействия in vitro, которая позволяет прямое и однородное воздействие клеток на частицы воздуха в воздушном жидком интерфейсе.
Воздействие клеток на чистый воздух не приводит к снижению жизнеспособности клеток с течением времени. Система воздействия была успешно проверена и создана в качестве модели прогнозирования острых ингаляционных опасностей испытанных соединений. Воздействие клеток A549 на различные испытательные вещества, которые не проявляли никакой, средней или сильной токсичности.
Пожалуйста, убедитесь, что вы строго сохранить временные рамки, которые инкубации раз, время времени времени генерации твердых частиц, и время осаждения твердых частиц. Этот метод воздействия в первую очередь предназначен для воздействия твердых частиц клеток, но может быть распространен на воздействие жидких аэрозолей и газов путем адаптации метода генерации аэрозолей. Этот метод скрининга позволяет качественно оценить ингаляционные частицы в отношении острой ингаляционной токсичности in vitro, тем самым уменьшая тестирование на животных, которое обычно дает эту токсикологическую оценку.
Не забывайте, что работа с токсичными испытательными веществами может быть чрезвычайно опасной и меры предосторожности, такие как ношение перчаток, маски, всегда должны быть приняты при обращении с такими соединениями.
