Das Screening von Partikeln in der Luft bezüglich der akuten lungenzytotoxizität durch die Exposition kultivierter menschlicher Lungenzellen am ALI mit diesem In-vitro-Expositionssystem kann dazu beitragen, Tierversuche zu reduzieren. Der Hauptvorteil dieses Expositionssystems ist das konzept der radialen Aerosolverteilung, das zu einer homogenen Verteilung und der Position der Partikel auf die Zellen führt. Vor der Aussaat der Zellen, fügen Sie 2,5 Milliliter gehärtetem Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer sechs Brunnen platte.
Platzieren Sie die Zellkultureinsätze ohne Zellen sorgfältig in den Brunnen und fügen Sie jedem Zellkultureinsatz einen Milliliter Wachstumsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Platten für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach der Trypsinisierung der Zellen 100 Mikroliter der Zellkultursuspension in einer Tasse mit 10 Milliliterisotonische Lösung gefüllt verdünnen.
Kippen Sie den Becher langsam ohne zu schütteln. Bestimmen Sie auf einem Zellzähler die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter und die Zelllebensfähigkeit basierend auf den zellspezifischen Messparametern von A549-Zellen. Nach dem Temperieren der Platte, aspirieren das Medium innerhalb der Zellkultur Einsätze und Samen einen Milliliter von A549-Zellen mit einer Dichte von dreimal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter in jeder Zellkultur einfügen.
Verteilen Sie die Zellsuspension durch sanftes Schaukeln und inkubieren Sie 24 Stunden lang. Stellen Sie die Presszeit über die Zeitsteuerung auf der Vorderseite der Presse ein. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr am Druckluftventil.
Stellen Sie mit dem Druckregler auf der Vorderseite der Presse den Druckdruck auf etwa zwei bar ein. Ziehen Sie die Schublade heraus, drücken Sie die Taste drücken, und lesen Sie den Druck auf den digitalen Druckschalter. Füllen Sie den Stoffbehälter mit einer kleinen Menge der Prüfsubstanz.
Setzen Sie den Kolben in den Stoffbehälter ein und drehen Sie ihn leicht hin und her, um das Pulver gleichmäßig im Behälter zu verteilen. Legen Sie den Stoffbehälter mit dem Kolben in die Schublade und drücken Sie die Taste drücken. Öffnen Sie die Schublade und entfernen Sie den Kolben.
Ein kritischer Schritt ist das Pressen von Prüfsubstanzen, die speziell zu einem Pulverkuchen im Stoffbehälter verdichtet werden müssen, um stabile Partikelexpositionen zu ermöglichen. Entfernen Sie den Einlassadapter und den Kondensatreflektor aus dem Aerosolführungsmodul. Schließen Sie die drei Aerosol-Fütterungsbohrungen im Aerosolführungsmodul mit Steckern und die mittleren Versorgungsanschlüsse am Probenahmemodul mit Dummyklappen.
Verbinden Sie die Vakuumleitungen mit dem Rohranschluss des Aerosolführungsmoduls. Verwenden Sie das Handrad, um das Modul zu schließen und den Wert der Durchflussregler zu messen. Ein paar Minuten nach dem Schließen sinken die Werte unter fünf Milliliter pro Minute.
Starten Sie die Aerosolgenerator-Software. Wenn sich der Stoffschaber nicht in der niedrigsten Position befindet, drücken Sie die Taste Homing-Modus. Stellen Sie den Stoffbehälter mit dem gepressten Prüfmaterial kopfüber über den Substanzschaber.
Stellen Sie sicher, dass das Glas des Stoffbehälters nach vorne zeigt. Legen Sie die Verriegelungsplatte in den Schlitz über dem Stoffbehälter und ziehen Sie die schwarze Schraube fest. Ändern Sie die Werte für Feed und Rotation in die gewünschten Einstellungen.
Verwenden Sie die Abwärtspfeile, um den Schlitten mit dem Stoffbehälter nach unten zu drücken, bis sich der Substanzschaber in der Nähe der gepressten Substanz befindet. Öffnen Sie die Druckluftzufuhr zum Aerosolgenerator mit einem Hahn des Massenstromreglers und starten Sie die Aerosol-Generierung, indem Sie auf die Starttaste klicken. Stellen Sie die Vorschubrate auf 15 bis 20 Millimeter pro Stunde ein, um lange Wartezeiten zu vermeiden.
Steuern Sie die richtige Partikelerzeugung, indem Sie die Feinstaubwolke mit einer kleinen Taschenlampe beobachten, die von unten hinter dem Glasrohr des Elutriators positioniert ist. Starten Sie die mittlere Versorgung mit vorgewärmten Belichtungsmedium und füllen Sie die Probenahmemodule, bis die Fallrohre abgedeckt sind, während das Modul geöffnet ist. Blindzellkultureinsätze in das Belichtungsmodul einlegen, das Belichtungsmedium nach unten pumpen, bis die Fallrohre mit Medium bedeckt sind und die Unterseite der Einsätze mit Medium in Kontakt ist.
Starten Sie den Aerosolgenerator, schließen Sie das Belichtungsmodul, und schließen Sie das Belichtungsmodul an den Belichtungsmodulausgang des Aerosolgenerators. 30 Minuten nach der Vorlaufzeit den Belichtungsmodulausgang des Elutriators mit einem Gummistecker versiegeln und die Blindeinsätze entfernen. Füllen Sie das Belichtungsmedium auf, bis die Fallrohre mit Medium bedeckt sind.
Entfernen Sie die Zellkultureinsätze von den sechs Brunnenplatten mit Hilfe einer Pinzette. Gießen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig aus der Zellkultur setzt durch Umstürzen der Einsätze und verwenden Sie eine Pipette, um die Restflüssigkeit zu aspirieren und zu entsorgen. Legen Sie die Einsätze in die Belichtungskammern der Belichtungs- und Reinluftmodule.
Schließen Sie die Module und starten Sie die Belichtungsexperimente, indem Sie das Belichtungsmodul gleichzeitig an den Expositionsmodulausgang des Aerosolgenerators und das Reinluftmodul an die Trägergasversorgung anschließen. Trennen Sie nach Abschluss des Experiments die Belichtungs- und Reinluftmodule und versiegeln Sie den Auslass des Belichtungsmoduls. Stoppen Sie die Druckluftzufuhr und den Aerosolgenerator, indem Sie auf die Stopp-Taste klicken.
Öffnen Sie das Belichtungs- und Reinluftmodul und übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer Pinzette auf die vorbereiteten Nachinkubationsplatten. Die sechs Brunnenplatten sowie die unbelichteten Zellkultureinsätze 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid an der Luftflüssigkeitsschnittstelle inkubieren. 24 Stunden nach der Belichtung die Zellkultureinsätze in die neu vorbereiteten sechs Brunnenplatten einlegen.
Fügen Sie jedem Zellkultureinsatz einen Milliliter der frisch zubereiteten WST1-Lösung hinzu. Die Platten sorgfältig schaukeln, um die Lösung homogen auf die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die sechs Brunnenplatten mit der Zellkultur Einsätze für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Danach 100 Mikroliter des Überstandes in Triplicaten von jeder sechs Brunnenplatte auf eine 96-Well-Platte übertragen. Mit einem Mikroplattenleser wird die Absorption bei 450 Nanometern mit einer Referenzwellenlänge von 650 Nanometern gemessen. Das CULTEX RFS ist ein speziell entwickeltes modulares In-vitro-Expositionssystem, das die direkte und homogene Exposition von Zellen gegenüber luftgetragenen Partikeln an der Luftflüssigkeitsschnittstelle ermöglicht.
Die Exposition der Zellen gegenüber sauberer Luft führt zu keiner Abnahme der Zelllebensfähigkeit im Laufe der Zeit. Das Expositionssystem wurde erfolgreich validiert und als Vorhersagemodell für akute Inhalationsgefahren der getesteten Verbindungen etabliert. Exposition von A549-Zellen gegenüber verschiedenen Prüfsubstanzen, die keine, mittlere oder starke Toxizität aufwiesen.
Bitte achten Sie darauf, dass Sie die Zeitrahmen, die die Inkubationszeiten, die Vorlaufzeit der Partikelerzeugung und die Partikelabscheidungszeiten sind, strikt einhalten. Diese Expositionsmethode ist in erster Linie für die Partikelexposition von Zellen konzipiert, kann aber durch Anpassung der Aerosolerzeugungsmethode auf die Exposition von flüssigen Aerosolen und Gasen ausgedehnt werden. Dieses Screening-Verfahren ermöglicht die qualitative Bewertung inhalierbarer Partikel hinsichtlich der akuten Inhalationstoxizität in vitro und reduziert damit Tierversuche, die normalerweise diese toxikologische Bewertung ermöglichen würden.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit toxischen Prüfsubstanzen extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen, einer Maske, immer beim Umgang mit solchen Verbindungen getroffen werden sollten.
