Bu işlemin genel amacı, kanonik olmayan amino asit birleşme ve tıklama kimyasını birleştirerek homojen bir glikokonlektolekaşı aşısı üretmektir. Genetik kod genişlemesi, doğal olmayan amino asitleri proteinlerin özelliklerine dahil ederek, yeni protein fonksiyonlarını incelemek veya oluşturmak veya protein konjugatörlerine erişmek için güçlü bir araçtır. Bir kodon bastırma yöntemi farklı pozisyonlarda doğal olmayan amino asitler dahil etmek için en popüler yöntem olarak ortaya çıkmıştır.
Bu metodoloji burada bir biyoortogonal fonksiyonel grup barındıran doğal olmayan bir amino asit içeren bir protein taşıyıcı üretimi için uygulanacaktır. Bu reaktif sap ı daha sonra homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için sentetik bir oligosakkarit hapteni özel ve verimli bir şekilde aşılamak için kullanılabilir. Propargyl-lizin, PrK, ticari Boc-lizin iki adımda sentezlenir.
İlk adımda, Boc-lizin korunmasız amino grubu propargyl kloroformate dönüştürülür. İkinci adımda, alfa amino grubu korumasızdır. N(alfa)Boc-propargyl-lizin sentezlemek için, ilk bir şişe sulu bir molar NaOH beş mililitre karışımı Boc-lizin 500 miligram eritmek ve bir şişe içinde THF beş mililitre ve silikon septum ile şişe uygun.
Şişeyi buz banyosunda soğutun ve tozun çözülmesini bekleyin. Sonra karıştırma altında 2-3 dakikalık bir süre içinde propargyl kloroformate damla-bilge ekleyin. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında ısıtın ve karıştırmaya 10 saat devam edin.
Diethyl eter, sulu bir molar hidroklorik asit ve etil asetat çözeltileri soğutun. Bir buz banyosunda ham reaksiyon karışımı nı soğutun. Karışımı ayıran bir huniye dökün.
Diethyl eter elli mililitre ile bir karışım ayıklayın. Çıkarma basınç birikmesi neden olabilir, sık sık herhangi bir basınç birikimi serbest emin olun. Sulu faz toplamak ve organik tabaka atın.
Ayırma hunisindeki sulu faza dikkatli bir şekilde, bir azı dişi hidroklorik asitelli mililitre ekleyin. Sonra, etil asetat otuz mililitre kullanarak iki kez sulu tabaka ayıklayın. Organik faz toplamak, TLC ile bileşik varlığını doğrulayın.
Bu aşamada, organik fazda olmalıdır. Magnezyum sülfat üzerinde kombine organik katmanları kurulayın. Katı fazdan süzün.
Ve bir döner evaporatör üzerinde azaltılmış basınç altında filtrasyon konsantre. Ham yağlı N(alfa)Boc-propargyl-lizin örneğini deuterated kloroform içinde çözünve nmr tarafından kimliğini kontrol. Propargyl-L-lizin sentezlemek için, bir septum ile donatılmış yuvarlak bir düğme şişesi nde N(alfa)Boc-propargyl-lizin tanıtın.
Argon altında şişe içine dört mililitre susuz diklorotan ekleyin. Karıştırma altında damla-bilge, trifloroasetik asit dört mililitre ekleyin. TFA'nın silikon septuma zarar vermesini önlemek için cam kapak için silikon septumu değiştirin.
Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında bir saat karıştırın. Boc-PrK'nın TLC tarafından korunmasını doğrulayın. Reaksiyon karışımını azaltılmış basınç altında yoğunlaştırın.
Ham kalıntıya dietil eter ekleyin. Propargyl-L-lizin'i, fritted-glass üzerinde beyaz bir katı şeklinde filtreleyin. Döteryum oksit propargyl-L-lizin bir aliquot eritin, sonra kimliğini ve saflığını kontrol etmek için NMR analizi yürütmek.
Propargyl-L-lizin sonra yüz milimolar son konsantrasyonda distile suda çözülür ve eksi 20 derece bir mililitre aliquots saklanır. Plazmidleri ifade süzmesine dönüştürmek için, kimyasal olarak yetkin E.Coli BL21'in yüz mikrolitrelik aliquot'unun beş dakika boyunca buz üzerinde çözülmesi. Hücrelere her plazmid veya elli yüz nanogram bir mikrolitre ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
Yetkili hücreleri 42 derecede, 45 saniye boyunca kuluçkaya yatırın. Sonra, iki dakika buza geri koyun. Antibiyotiklerifade sağlamak için 37 derece bir saat sallayarak altında LB orta ve inkübat dokuz yüz mikrolitre ekleyin.
Sonra antibiyotik ile LB agar üzerinde dönüştürülmüş bakteri plaka. Bakterilerin bir gecede 37 derecede büyümesine izin verin. PrK ile modifiye proteinleri ifade etmek için, antibiyotikler ile LB orta beş mililitre tek bir co-dönüştürülmüş koloni aşılamak.
Bir gecede 37 derecede sallayarak kuluçkaya yat. Ertesi gün, antibiyotik içeren otomatik indüksiyon aracı beş yüz mililitre birincil kültürün beş mililitre ile seyreltmek, L-arabinose% 0.02, ve PrK bir milimolar ve 37 derece sallayarak altında 24 saat boyunca kuluçka. Yabani tip protein geni içeren bir klonun kültürünü gerçekleştirerek PrK olmadan kültürü ve pozitif kontrolü gerçekleştirerek negatif kontrol ekleyin.
10 dakika boyunca 5, 000 x g santrifüj ile gece kültüründen hasat hücreleri. Supernatant atın ve eksi 20 derece pelet dondurun. Proteinin yerçekimi akış-tezgah afiyeti kromatografisi ile saflaştırılması için hücre peletlerini yirmi mililitre likis tamponuna dönüştürün.
DNase I ve lysozyme ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece süspansiyon kuluçka tarafından lysis izin verin. Beş dakika boyunca buzdaki hücreleri sonicate, sonra 30 dakika boyunca 20, 000 x g santrifüj ile hücre enkaz kaldırın. 0,45 mikrometre filtre ile lytrate süspansiyon için Ni-NTA rezorna ekleyin.
Bir saat boyunca dört derecede hafifçe karıştırılır. Bir polipropilen sütuniçine süspansiyon dökün ve bağlanmamış fraksiyonu toplamak. Rekarnı on mililitre ve ardından beş mililitre yıkama tamponuile yıkayın.
Yıkama kesirlerini toplayın. Bir milimetre lik elüsyon tamponu ile His-tagged protein elute ve bu adımı dört kez tekrarlayın ve tüm ek kesirleri toplamak. Saf histidin etiketli proteinler içeren fraksiyonları birleştirin ve diyaliz membran kullanarak bir gecede TEV proteaz tampon bir litre içine diyaliz.
Protein örneğini 50 mililitrelik bir tüpe toplayın ve bir mililitrenin son hacminde mililitre başına iki miligramlık son konsantrasyonelde etmek için TEV tamponu ekleyin. TEV proteaz yüz mikrolitre ekleyin. 0.1 molar DTT 50 mikrolitre ekleyin.
Beş mililitreye kadar TEV tamponu ile tamamlayın. Bir gecede dört derece kuluçka, yavaş sallayarak. EDTA kaldırmak için, beş milimolar imidazol ile diyaliz membran ve fosfat tampon kullanarak bir gecede dört derece protein diyaliz.
TEV proteaz ve sindirilmemiş proteinleri ortadan kaldırmak için, Ni-NTA boncukile karışımı kuluçkaya yatırın ve dört derecede bir saat hafifçe karıştırın. Süspansiyonu polipropilen kolona dökün. Bağlanmamış kesir toplandı.
TEV proteaz ve sindirilmemiş proteinler boncuklara bağlı kalır ve sindirilmiş protein eluted. Beş mililitre yıkama tamponu ile sütunyı yıkayın ve yıkama kesirlerini de toplayın. Diyaliz membranı ile bir gecede dört derece tıklama tampon bir litre karşı sindirilmiş protein diyaliz yanı sıra tampon değişimi için imidazol kaldırmak için.
Ve proteinin konsantrasyonunu 280 nanometre de ölçün. 6-hexachloro-fluorescein-azide veya bir panzehir-fonksiyonel karbonhidrat antijeni ile mPsAA eşleştirmek için, iki mililitrelik mikro tüp içine 57.8 mikromolar konsantrasyonda PrK mutasyona uğramış protein koymak. Beş milimolar azit bileşik 10 mikrolitre ekleyin, sonra bakır sülfat çözeltisi ve THPTA bir ön karışımı ekleyin.
Aminoguanidin hidroklorür ekleyin. Sodyum askorbat extemporaneously hazırlanmış sulu çözelti ekleyin. Tüpü kapatın, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve iki saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun. SDS sayfasındaki çekimi kontrol edin. Göçten sonra, floresan ile eşlekap için 312 nanometre UV ışığı üzerinde jel görselleştirin.
Veya karbonhidrat antijeni ile eşlenik görselleştirmek için Coomassie Mavi ile jel leke. Hapten eklenmesi olarak moleküler ağırlık bir değişiklik neden olmalıdır. Glikokonjugate PBS ile dengede bir jel filtrasyon sütununa uygulayarak arındırın.
Glikokonjugates içeren kesirleri toplayın. Uzun süreli depolama için, distile suya karşı glikokonjugate diyaliz, sonra dondurularak kuru ve eksi 80 derece glikokonjugate saklayın. PrK, PsaA'nın N-terminusu yakınlarındaki bir lizin yerine 32.
MPsaA üretiminin etkinliği Anti-Histidin etiket antikor kullanılarak SDS sayfası ve Batı leke analizi ile kontrol edilmiştir. Tam uzunlukta bir proteinin varlığı PrK'nın başarılı bir şekilde birleştirilmesine işaret eder. Yoğunluğu, ancak, yabani tip milletvekilleri için gözlenen daha düşüktür.
Milletvekilleri Ni-NTA boncuklar üzerinde saflaştırılmıştır.). Sekiz miligram tipik bir verim ve PrK kalıntısı dahil nihayet kütle spektrometresi tarafından doğrulandı. Histidin etiketi TEV proteaz kullanılarak proteolitik dekolte üzerine kaldırıldı.
MPsaA(K32PrK) alkine reaktivitesi azido-fonksiyonel floresan kullanılarak değerlendirildi ve sentetik oligosakkarit antijeni konjuvet için kullanıldı. Kontrol olarak vahşi tip milletvekilleriile karşılaştırıldığında deneyler yapılmıştır. Son olarak, glikokonjugate jel filtrasyon ve kitle spektrometresi tarafından doğrulandı kimliği ile saflaştırılmış oldu.
Bu projede, homojen glikokonkonjuge aşılar tanımlanan siteler altında doğal olmayan bir amino asit dahil etmek için amber stop kodon bastırma teknolojisi kullanılarak hazırlanmıştır. Glikokonjugate aşı homojenliği tam fiziko-kimyasal karakterizasyonu sağlamak için önemli bir kriterdir. Ve bu nedenle, daha fazla ve daha zorlu uyuşturucu ajansı önerileri tatmin edici.
Bu ölçüt klasik saf çekim yöntemi kullanılarak tatmin edilmez. Ayrıca, bu protokol glikokonjugate aşısının yapısını hassas bir şekilde ayarlamayı mümkün kılmıştır. Homojenlik ve glikokonjugate yapısı arasındaki ilişkiyi incelemek için benzeri görülmemiş bir araç doğurarak.
