Bu protokol Pseudomonas aeruginosa sürüsü zaman atlamalı filmler üretmek ve bakteriyofaj veya antibiyotikler tarafından sürüsünün itme yakalamak için kullanılabilir. Hızlandırılmış filmler antibiyotikler ve bakteriyofaj için swarming yanıt ayrıntılı dinamikleri yakalamak ve teknik sadece bir nem giderici, bilgisayar, kuluçka makinesi ve belge tarayıcı gerektirir. P.aeruginosa sürü zaman atlamalı görüntüleme için sürü halindeagar plakaları hazırlamak için, her 10 santimetre çapındaki Petri kabına 20 mililitre lik bir agar çözeltisi eklemek için 25 mililitrelik bir pipet kullanın.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca kapakları ile tek bir yığın tabak yerleştirin. Odanın bağıl nemini %40-50'ye düşürmek için nem gidericiyi açın, agar katılaştırDığında, swarming agar plakalarını kapakları kapalı laminar akış kaputunda 30 dakika daha kurulayın ve oda sıcaklığında %40-50 bağıl nemle dakikada 300 metreküple karşı karşıya bırakın. Daha sonra kurutulmuş sürü halindeki agar tabaklarını 4 santigrat derecede 24 saate kadar saklayın.
Agar kaplama swarming için, bir gecede P.aeruginosa kültüründen bir gecede P.aeruginosa kültüründen beş mikrolitre ile yüklenen bir P20 pipet ucu tutun 10-45 derecelik açıyla 2-1/2 santimetre bir swarming plaka merkezi üzerinde ve sadece sıvı damla ile agar dokunmadan ilk durdurmak için piston depress. Farklı sürü halindeki agar plakaları arasında noktayı tutarlı bir şekilde konumlandırmak için bir şablon kullanın. Bir faj enfeksiyonu plaka için, ilk karışımı 30 mikrolitre gecede kültürlü P.aeruginosa altı mikrolitre bir kez 10 faj DMS3 vir mililitre başına 12 plak şekillendirme birimleri ve hemen gösterildiği gibi 2.8 santimetre yarıçapı eşmerkezli daire üzerinde altı eşit uzaklıktauydu pozisyonlarında P.aeruginosa faj karışımı altı mikrolitre ekleyin.
Farklı sürü halindeki agar plakaları arasında noktayı tutarlı bir şekilde konumlandırmak için bir şablon kullanın. Plaka antibiyotik tedavileri için, ilgi antibiyotik uygun konsantrasyon ve hacmi ile gece kültürlü P.aeruginosa 30 mikrolitre karıştırın ve hemen çanak merkezi hakkında 2.8 santimetre yarıçaplı konsantrik daire üzerinde altı eşit uzaklıkta uydu pozisyonlarında antibiyotik tedavi bakterilerin altı mikrolitre ekleyin. Farklı sürü halindeki agar plakaları arasında noktayı tutarlı bir şekilde konumlandırmak için bir şablon kullanın.
Tüm kültürler kaplandığında, açık Petri çanak kapakları özel yapım siyah kapaklarla değiştirin. Dikkatle bir kuvöz 37 derece santigrat bir 10 litresu banyosu ile bir tarayıcı üzerinde sürühalinde agar plakaları yerleştirin 75% nem korumak için plakaları tarayıcı içine yerleştirdikten sonra, dosyayı açın ve görüntüler için tasarruf yolunu ayarlamak için ayarları kaydedin ve 30 dakikalık aralıklarla tarayın ve Tamam tıklayın. Görüntü edinimi otomatikleştirmek için komut dosyası yazılımını kullanın.
Hem boşta tarama hem de tek tarama seçeneğini belirleyin ve boşta tarama üzerine sağ tıklayın, ardından etkin olana sol tıklayın. Kuluçka süresinin sonunda, taranmış tüm görüntüleri ImageJ'e aktarın. Sıra seçenekleri penceresinde, görüntü sayısı seçilen görüntü sayısını gösterir.
Resimlerin orijinal boyutunu korumak için klasördeki ilk resimden başlamak için görüntüyü ve ölçek görüntülerini %100 olarak başlatın. Görüntüleri renkli tutmak için RGB için gizli'ye tıklayın. Sanal yığını işaretlenmemiş olarak kullanın ve resimleri yüklemek için Tamam'ı tıklatın.
Görüntüleri AVI dosyasında birleştirmek için dosyayı tıklatın, olarak kaydedin ve AVI'yi tıklatın. Sıkıştırmayı JPEG'e ve kare hızını saniyede beş kare olarak ayarlayın. Ardından AVI zaman atlamasını uygun depolama klasörüne kaydedin.
Lb suyu bir LB agar plaka bir LB agar plaka gecede 37 derece santigrat ve bir sürü agar plaka merkezine tespit vahşi tip P.aeruginosa tek bir koloni zaman atlamalı görüntüleme koloniden yayılan tendrils yayılan plaka merkezinde bir koloni şeklinde bir ilk büyüme ortaya koymaktadır. Sürüler, sürüler, sürü agar plakalarının merkezinden çevreye doğru hareket eder ve fajlarla enfekte olmuş veya Gentamisin ile tedavi edilen bakteriler tarafından yayılan bir stres sinyali yle püskürtülürler. Uydu pozisyonlarında tek başına görülen fajlar veya Gentamisin, kalabalık popülasyonların bu alanlardan kaçınmasına neden olmaz.
Sürühalindeki agar plakalarının tam olarak 20 mililitre içerdiğinden emin olmak için 25 mililitrelik pipet kullanın. Plaka nın kuruma süresini laboratuvar ortamına göre ayarlamak da önemlidir. Tekniğimiz Pseudomonas aeruginosa popülasyonlarının genel sürü desenlerini görselleştirmemizi sağlar.
Bir sonraki amaç Brightfield mikroskobu kullanarak bireysel hücre hareketliliğini izlemektir.
