Bu yöntemin genel amacı, stres tedavisinin hem tek hücrede hem de popülasyon düzeyinde bakteri hücreleri üzerindeki etkisini analiz etmektir. Bu hücre canlılığı, morfolojisi ve DNA içeriği de dahil olmak üzere bakteri üremesi çeşitli yönleri üzerinde stresin etkisi küresel bir vizyon sağlar. Ayrıca nüfus kurtarma karakterize sağlar.
Bu yöntem ilaç endüstrisinde yeni antimikrobiyal molekülün aktivitesini taramak ve bakterilerin canlılığı ve büyümesi üzerindeki etkilerini takdir etmek için kullanılabilir. Strese neden olan tedavi, doz ve zamana bağlı gibi bir verimsizliğe sahiptir. Bu protokole başlamadan önce optimal dozu ve tedavi süresini belirlemek için ön testlerin yapılması gerekebilir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, her kritik adımın önemli ayrıntılarını niçin doğru şekilde gerçekleştireceklerini hayal etmenizi sağlar. Başlamak için, E.Coli MG1655 HU-PAmCherry tek bir koloni ile MOPS EZ Zengin Tanımlı Orta beş mililitre aşılamak ve bir gecede dakikada 140 rotasyonlar sallayarak 37 derece santigrat büyümek. Ertesi sabah, numunenin 100 mikrolitresini ayıklayın ve optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçmek için 900 mikrolitre orta ile seyreltin.
Daha sonra, 0,01 bir OD600 nanometre taze orta içeren bir test tüpü kültürü seyreltmek. Optik yoğunluk 0,2'ye ulaşana kadar 140 RPM'de sallayarak 37 santigrat derecede aşılanmış test tüpünü kuluçkaya yatırın, bu da zengin ortamda tam üstel faza karşılık gelir. Daha sonra, zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme, seyreltme ve kaplama tahlil, akış sitometri analizi ve mikroskopi enstantane görüntüleme için kültür örnekleri aliquot.
Test tüpündeki kalan 4,4 mililitre hücre kültürünü belirli stres tedavisine maruz bırakın. Örneğin, mililitre başına beş mikrogram ve 140 RPM sallayarak 37 santigrat derecede kuluçka sefaleksin 4.4 mikrolitre. Taze ortamda 200 mikrolitre kültür numunesinin 10 ila 7'nci derecesini kadar on kat seri seyreltme hazırlayın.
Çok nazik girdap veya tüp ters çevirerek her seyreltme arasında karıştırın. Plaka 100 mikrolitre uygun seyreltme olmayan seçilmiş LB agarose plakaları ve inkübasyon gecede 37 santigrat derece. Ertesi gün, her kültür örneğinde canlı hücrelerin konsantrasyonu belirlemek için kolonilerin sayısını saymak.
İşlenmemiş ve tedavi edilen hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak mililitre başına CFU'yu çizin. Kültürün OD600'ini spektrofotometrede ölçün. Mikrolitre başına yaklaşık 15.000 hücreye karşılık gelen 0,06'da OD600 ile numune almak için kültür örneğini dört santigrat derecede taze orta ile seyreltin.
DNA boyama için seyreltilmiş bakteri örneğini, dna floresan boyanın mililitre çözeltisi başına 10 mikrogram ile bire bir hacim rasyonda karıştırın ve karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın. Numunenin enjeksiyonundan önce, numuneyi çok nazik girdaplarla veya tüpü ters çevirerek karıştırın. Dakikada yaklaşık 120,000 hücrelik bir akış hızında numuneyi akış sitometresine geçirin.
Uygun ayarlarla ileriye dağılmış ve yan alıkonan ışığın yanı sıra DNA floresan boya/floresan sinyali elde edin. Hücre büyüklüğünün dağılımını temsil etmek için ileriye dağılmış hücre yoğunluğu histogramını çizin ve hücre popülasyonundaki DNA içeriğini temsil etmek için DNA floresan boya/floresan hücre yoğunluğu histogramını çizin. İlk olarak, sıcaklığı dengelemek için termosesif mikroskop haznesini 37 santigrat derecede önceden ısıtın.
El yazmasında açıklandığı gibi agarose monte slaytlar hazırlayın. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve iletilen ışığı yüz kontrastı hedefiyle ve mCherry için 560 nanometre ışık kaynağı uyarma ile görüntü edinimi gerçekleştirin. Görüntü analizi sırasında otomatik hücre algılamasını kolaylaştırmak için yalıtılmış hücreler içeren görünüm alanlarını seçin.
Hücre popülasyonunun sağlam istatistiksel analizine olanak sağlamak için en az 300 hücrenin görüntülendirilediğinden emin olun. İlk olarak, koruma çözeltisini mikroakışkan plakadan çıkarın ve Mikroakışkan Yazılım Kullanım Kılavuzu'nda açıklandığı gibi önceden ısıtılmış 37 dereceye kadar önceden ısıtılmış taze ortamla değiştirin. Mikroakışkan plakayı manifold sistemine takın.
Ve mikroakışkan yazılımda, plakayı manifold sistemine kapatmak için Seal düğmesine tıklayın. Bundan sonra, Priming düğmesine tıklayın. Mikroakışkan haznenin genişlemesini önlemek için mikroakışkan plakayı mikroskop aşamasında manifold sistemi yle yerleştirin ve 37 derece santigrat derecede iki saat önceden ısıtın.
Seal Off düğmesine tıklayarak mikroakışkan sistemdeki mikroakışkan plakayı kapatın. Ortayı kuyu sekizden 150 mikrolitre kültür numunesi ile değiştirin ve ortayı 1'den 5'e kadar istediğiniz ortamla değiştirin, strese neden olan reaktifle veya strese neden olan reaktifolmadan. Mikroakışkan plakayı kapatın ve mikroskop aşamasına yerleştirin.
Mikroakışkan yazılımda, hücre yükleme işlemini çalıştırın. Aktarılan ışıkta mikroskop altına bakarak hücrelerin yüklenmesinin tatmin edici olup olmadığını kontrol edin. İletilen ışık moduna dikkatlice odaklanın ve izole edilmiş bakterileri gösteren ve aşırı kalabalık olmayan çeşitli görüş alanlarını seçin, 100 kare mikrolitrede yaklaşık 10 ila 20 hücre.
Mikroakışkan yazılımda, Özel Sırayı Çalıştır düğmesine tıklayın, ardından iki PSI'da 10 dakika boyunca strese neden olan ortamın enjeksiyonuna program verin ve ardından stres tedavisinin istenen süresi boyunca bir PSI'ya enjeksiyon uyguluyoruz. İletilen ışıkta faz kontrastı ve gerekirse mCherry sinyali için 560 nanometre uyarma ışık kaynağı kullanarak, her 10 dakikada bir kare ile zaman atlamalı modda mikroskopi görüntüleme yapın. Mikroskobik görüntü edinimi ve mikroakışkan enjeksiyon protokolünü aynı anda başlatın.
Fiji yazılımını ve MicrobeJ eklentisini açın. Anlık görüntü analizi için, görüntüleri biraraya getirmek ve elde edilen görüntü yığınları dosyasını kaydetmek için bir mikroskop slaytına karşılık gelen tüm görüntüleri MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakın. Hızlandırılmış veriler için görüntü yığınını MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakmanın.
Faz kontrast ı görüntüsünün segmentasyonuna dayalı olarak hücrenin anahatlarının otomatik olarak algılanmasını çalıştırın ve lekeli DNA floresan sinyalinin segmentasyonuna dayalı nükleoidlerin algılanmasını çalıştırın. Hücre algılamanın doğruluğunu görsel olarak kontrol edin ve gerekirse düzeltme için MicrobeJ düzenleme aracını kullanın. Elde edilen sonuç dosyasını kaydedin.
Analizi tamamlamak ve ResultJ penceresini elde etmek için ResultJ simgesine tıklayın. Birçok farklı türde çıktı grafiği oluşturulur. Hücre şekli veya uzunluğu ve hücre başına ortalama nükleoid sayısı normalleştirilmiş histogramları çizin.
Bu çalışma, özellikle hücre bölünmesini inhibe eden bir antibiyotik olan sefaleksine geçici maruzkalma sırasında Escherichia coli K-12 hücrelerinin davranışını analiz etti. Sefateksin varlığında büyüyen hücre kültürleri, stresli olmayan kültürler gibi benzer OD600 artışlar sergiledi. Sefaleksin mevcut olduğunda canlı hücrelerin konsantrasyonu artmadı.
Cephalexin çıkarıldığında hücreler tekrar bölünmeye başladı ve iki saat sonra stressiz kültüre eşdeğer bir konsantrasyona ulaştı. Farklı gerilmeler, indüklenen etkiye bağlı olarak mililitre eğrileri başına OD ve CFU'nun farklı bir şekilde ayrılmasıyla sonuçlandı. Sefaleksin maruz hücre büyüklüğü ve DNA içeriği paralel bir artışa yol açtı.
Sefaleksin çıkarıldığında, nüfus hücre büyüklüğü ve DNA içeriği yavaş yavaş azaldı ve iki saat sonra stressiz nüfusa benzer hale geldi. Sefaleksin normal hücre genişliği ile uzun hücrelerin oluşumunu kışkırttı sonra hiçbir bölünme septa. Kantitatif görüntü analizi hücre boyutunu ve DNA içeriğinin arttığını doğruladı.
Hızlandırılmış görüntüler, hücre uzaması ve kromozom replikasyonu ve segregasyonunun sefaleksine maruz kalarak inhibe olmadığını doğrulamaktadır. Filamentli hücre soyundan gelen analizler, hücre bölünmesinin ilacı yıkadıktan yaklaşık 20 dakika sonra yeniden başladığını gösterdi. Bu bakteriyel popülasyon stres tedavileri indüklemeden önce tam üstel büyüme olduğundan emin olmak için çok önemlidir.
Bu yaklaşımlar için kullanılan stres indükleme tedavisi deneysel için tehlikeli olabilir, genotoksik bileşik gibi. Bu yüzden bileşiği dikkatlice kullanın ve eldiven, maske, gözlük ve laboratuvar önlüğü giyin.
