Bu çalışma, Wellcome Trust (091549 S.G.'ye ve 109093/Z/15/A'dan S.M.'ye), Wellcome Trust Centre for Cell Biology çekirdek hibesi (092076) ve Tıbbi Araştırma Konseyi Klinik Olmayan Kıdemli Araştırma Bursu (MR/R008205/1'den S.G.'ye), Avrupa Moleküler Biyoloji Örgütü'nden uzun süreli doktora sonrası burs (ALTF 1070-2017'den R.A.C.'ye) tarafından desteklenmiştir. ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu (T.H.J).

A. Langford ve W. Worboys, ticari bir şirket olan UVO3'e bağlıdır. Çalışma tasarımında, veri toplama ve yorumlamada veya çalışmayı yayınlanmak üzere gönderme kararında hiçbir rolleri yoktu.

Yeni çapraz bağlama ve hücre toplama cihazlarıyla birleştirilen χCRAC yöntemi, çok çeşitli model organizmalara uygulanabilir olduğu ve bu nedenle RNA alanına genel ilgi göstermesi gerektiği için büyük bir potansiyele sahiptir. χCRAC'ın kullanılabileceği birçok alan vardır. Örneğin, yöntem, proteinlerin hiyerarşik montajını, genellikle proteinler ve RNA molekülleri arasındaki dinamik etkileşimleri içeren splisozom ve ribozom gibi büyük makromoleküler komplekslere ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, hücreler çeşitli streslere maruz kaldıklarında RNA bozunma faktörleri ve substratları arasındaki etkileşimleri izlemek için rutin olarak kullanıyoruz. Bu, adaptif yanıtın hangi aşamasında bu faktörlerin en aktif olduğunu, hangi substratlara bağlandıklarını ve bu etkileşimlerin ne kadar dinamik olduğunu belirlememizi sağlar. Bu tür veriler, araştırmacıların çevresel değişikliklere adaptasyonda her bir faktörün göreceli katkısını belirlemelerini sağlamalıdır.
χCRAC, proteini son derece sıkı ve denatüre edici koşullar altında saflaştırmak için çift afiniteli saflaştırma etiketleri (HTF veya HTP) kullanır. Bu, kosafifiye RNA'nın, ilgilenilen proteine kovalent olarak çapraz bağlanmış RNA'lar için yüksek oranda zenginleştirilmesini sağlar. Ancak, benzeşim etiketlerine güvenmenin dezavantajları vardır. Örneğin, etiket protein fonksiyonuna müdahale edebilir, bu da RNA bağlayıcı interaktomunun çarpık bir okumasını verebilir. Ek olarak, bazı model organizmalar için etiketleri kullanmak her zaman mümkün olmayabilir, çünkü DNA parçalarını genoma entegre etmek veya ekspresyon plazmidlerini dönüştürmek için genetik araçlar henüz mevcut değildir. Bununla birlikte, χCRAC protokolünün bazı bölümlerini, RBP'nin saflaştırılması için antikorlara dayanan CLIP tabanlı protokollerle uyumlu hale getirmek için değiştirmek kolaydır. Gerçekten de, bu çalışma iCLIP bazlı saflaştırmaları çapraz bağlayıcımızla birleştirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Şimdi, insan RNA bağlayıcı proteinlerinin yeni ortaya çıkan RNA transkriptleriyle zamansal ilişkisini incelemek için CLIP protokolleri geliştirme sürecindeyiz.
Yeni bir protein üzerinde χCRAC gerçekleştirirken, maksimum çapraz bağlanmayı indüklemek için UV maruziyeti optimize edilmelidir. Bu önemlidir, çünkü yüksek UV maruziyeti, saflaştırma adımı sırasında RNA'nın geri kazanımını azaltabilir. Rekombinant RBP'yi eksprese eden hücreler çeşitli UV dozlarına, 100 mJ / cm2, 250 mJ / cm2, 500 mJ / cm2 ve 1 J /cm2'ye maruz bırakıldı. RNP'ler daha sonra yakalandı ve RNA'lar parçalandı ve radyo-etiketlendi. Daha sonra, RNP'ler SDS-PAGE tarafından çözüldü ve hangi maruziyetin en yoğun sinyali verdiğini (yani maksimum çapraz bağlama) çıkarmak için bir otoradyogram alındı.
Deney koşulları optimize edildikten sonra, χCRAC gerçekleştirilirken birkaç kontrol deneyi önerilir. İlk olarak, saflaştırma boncuklarına arka plan bağlanmasını izlemek için UV ışınlanmış, etiketlenmemiş bir numune kullanılabilir. İkincisi, bir vardiya deneyi sırasında χCRAC uygulanırken, hücrelerin orijinal ortama geri kaydırıldığı ikinci bir zaman serisi, hücrelerin filtrasyonunun kendisinin RNA seviyelerinde veya protein-RNA etkileşimlerinde değişikliklere neden olup olmadığının araştırılmasını sağlar.
Giriş'te belirtildiği gibi, yakın zamanda yayınlanmış çok sayıda makale, CLIP protokolünde bir dizi optimizasyon önermektedir. Bu, kızılötesi tarama10 yoluyla protein-RNA kompleksini tespit etmek için floresan olarak etiketlenmiş adaptörlerin kullanımını ve ayrıca ortaya çıkan kütüphanelerin karmaşıklığını arttırdığı gösterilen çeşitli nükleik asit saflaştırma ve boyut seçim adımlarına optimizasyonları içerir12,45. Şu anda χCRAC protokolünü daha da hassaslaştırmak için bu iyileştirmelerden bazılarını uyguluyoruz. Burada sunulan protokol, verilerin karmaşıklığını artıran orijinal CRAC ve χCRAC protokollerinde bir dizi iyileştirme içermektedir. Örneğin, daha önce, SDS-PAGE jelleri üzerindeki çapraz bağlı, radyoaktif protein-RNA komplekslerini çözdükten sonra, bir nitroselüloz membranına aktarıldı ve çapraz bağlı RNA lekeden izole edildi. Bununla birlikte, RNP'nin transferi ve ardından RNA ekstraksiyonu, özellikle RNA polimeraz alt birimleri gibi büyük RBP'lerle uğraşırken çok verimsiz olabilir. Bu, çapraz bağlı RNA'nın geri kazanımında önemli bir azalmaya neden olabilir. Mevcut protokolde, çapraz bağlı RNA, Şekil 1'de gösterildiği gibi doğrudan SDS-PAGE jel dilimlerinden ekstrakte edilir. Bu, çapraz bağlı RNA'ların geri kazanımını arttırdı. Ek olarak, cDNA'ların PCR amplifikasyonundan sonra, ürün başlangıçta% 3, düşük erime sıcaklıklı agaroz jelleri üzerinde çözüldü ve daha sonra jelden 175-300 bp PCR ürünleri ekstrakte edildi. Bununla birlikte, bu jeller kolayca aşırı yüklenebilir ve bu da DNA'nın çok zayıf bir şekilde ayrılmasına neden olur. Agaroz jellerinin prekast TBE jellerle değiştirilmesi, daha tutarlı boyut ayrımı ve PCR ürünlerinin daha iyi geri kazanılması ile sonuçlandı.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA'lar genellikle işlevlerini yerine getirmek için RBP'lere güvenirler, bu da bu moleküller arasındaki dinamikleri anlamaya büyük ilgi duymuştur. Birçok RBP, çok çeşitli organizmalarda tanımlanmıştır. Bununla birlikte, RBP-RNA etkileşimlerini in vivo olarak incelemek her zaman zor olmuştur. Bu tür etkileşimlerin incelenmesinde büyük bir atılım, CLIP1'in ortaya çıkmasıyla geldi. Bu yöntem, RBP'ler ve doğrudan bağlı RNA'ları arasındaki kovalent bağları (yani, sıfır mesafeli çapraz bağlama) indüklemek için ultraviyole (UV, 254 nm) ışınlamasını kullanır. Daha sonra, ilgilenilen RBP, yalnızca proteinlere kovalent olarak çapraz bağlı RNA'ların tanımlanmasını sağlamak için sıkı koşullar altında immünosaflaştırılır. Bağlı RNA'lar daha sonra RNazlarla kısmen sindirilir ve daha sonra dizileme için cDNA kütüphanelerine dönüştürülür. Yüksek saflaştırma sıkılığı, çapraz bağlı ribonükleoprotein (RNP) kompleksinin SDS-PAGE saflaştırılmasıyla daha da geliştirilen protein ve RNA geri kazanımının özgüllüğünü büyük ölçüde arttırdığı için önemlidir. CLIP ve ilgili yöntemler ayrıca protein bağlanma bölgesine nükleotid çözünürlüğü anlayışı sağlar, çünkü dizileme kütüphanesinin hazırlanması sırasında, RNA'ya çapraz bağlanan amino asitler sıklıkla ters transkriptazı sonlandırır veya enzimin bu bölgede mutasyonlar oluşturmasına neden olur 1,2,3.
Tanıtılmasından bu yana, orijinal CLIP protokolü dikkate değer çeşitlilikte türev metodolojileri üretmiştir. Özellikle önemli bir atılım, yüksek verimli sıralamayı CLIP yaklaşım3 ile birleştiren HITS-CLIP'in (veya CLIP-seq) geliştirilmesiyle geldi. Bu, o zamandan beri tüm CLIP tabanlı metodolojiler tarafından benimsenmiştir. iCLIP, RBP bağlama bölgelerinin daha doğru haritalanmasını kolaylaştıran RNase aracılı kırpma ve adaptör ligasyon tekniklerinde iyileştirmeler getirmiştir4. PAR-CLIP, 4tiyo-idrar / urasil etiketlemeyi 365 nm'de çapraz bağlama ile birleştirerek, T-C ikamelerini analiz ederek çapraz bağlama bölgelerini haritalamayı mümkün kıldı5. CRAC, üre-iCLIP, dCLIP ve uvCLAP, afinite reçinesine arka plan bağlanmasını daha da azaltan ve protein yakalama 2,6,7,8,9'un özgüllüğünü daha da artıran denatüre etme koşulları ve çift afinite saflaştırma adımları getirmiştir. Ek olarak, CRAC, uvCLAP ve dCLIP, ilgilenilen RBP'yi bir afinite etiketi ile etiketlemeyi tanıttı, böylece spesifik antikorlar üretme ihtiyacının üstesinden geldi.
CLIP metodolojisini hızlandırmak için çeşitli optimizasyonlar da yapılmıştır. Orijinal CLIP protokolü, SDS-PAGE'den sonra RBP-RNA komplekslerini görselleştirmek için yakalanan RNA'ların radyoetiketlemesini kullandı. Bununla birlikte, radyoaktivite kullanımı, bu tür çalışmalar için kurulmamış laboratuvarlar için sorunlu olabilir. irCLIP, kızılötesi görüntüleme10 yoluyla görselleştirmeyi kolaylaştıran florofor kuplajlı bir adaptör içerir ve sCLIP, streptavidin konjuge HRP11 aracılığıyla görselleştirmek için yakalanan RNA'ların biyotinilasyonunu kullanır. Ayrıca, eCLIP RNA etiketlemesinden tamamen vazgeçer; bunun yerine, protein sadece bilinen büyüklüğüne göre eksize edilir12. Streptavidin bazlı saflaştırma, biyotinillenmiş bir 3' adaptörün RNA'lara bağlandığı ve ters transkripsiyon ve daireselleştirme13'ten sonra saflaştırmayı sağlamak için kullanıldığı FAST-iCLIP'de kütüphane hazırlama sürecini hızlandırmak için de kullanılmıştır. iCLIP protokolündeki ek geliştirmeler de kütüphanelerin karmaşıklığını büyük ölçüde artırdı4.
Son olarak, CLIP, RBP'lerin farklı hücresel alt bölmelerden 14,15'ten yakalanmasını sağlamak, fotoaktive edilebilir ribonükleozitlerindarbeli indüksiyonu kullanılarak yeni transkribe edilmiş RNA'ları görselleştirmek için 5,16,17, metillenmiş RNA'ları yakalamak için18,19,20, RNA-RNA etkileşimlerini incelemek21,22 ve 3' uçlarını haritalamak için modifiye edilmiştir 23,24.
RBP'ler ve RNA'lar arasındaki etkileşimleri anlamamıza yardımcı olan CLIP tabanlı tekniklerin büyük katkılarına rağmen, UV çapraz bağlamanın verimsizliği ile sınırlandırılmıştır. Tek katmanlı bir tabakada yetiştirilen kültür hücrelerinin çapraz bağlanması genellikle nispeten kolay olsa da, bu dokularda veya çözeltideki hücrelerde önemli ölçüde daha zordur. Dokular, gerekli hücre katmanlarına nüfuz etmek için birden fazla UV maruziyeti turu gerektirebilirken, mikrobiyal hücreler genellikle aromatik, UV emici bileşikler içeren zengin ortamlarda yetiştirilir25. Gerçekten de, bu tür örnekler için RBP'ler ve bağlı RNA'ları arasında yeterli çapraz bağlantı oluşturmak için 30 dakikaya kadar UV ışınlama süreleri kullanılmıştır26,27,28. Bu genişletilmiş UV maruziyeti, hücre içinde, bazı uygulamalarda nihai verileri kirletebilecek UV kaynaklı DNA hasarı gibi stres tepkilerini indükler.
CLIP çalışmalarının çoğu, bir hücredeki spesifik protein-RNA etkileşimlerinin tek bir "anlık görüntüsünü" üretmeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, protein-RNA etkileşimleri, özellikle hücreler çevrelerinde değişikliklere maruz kaldıklarında doğal olarak dinamiktir. Bu, temel besin maddelerinin mevcudiyetinde ani bir azalma veya sıcaklıktaki hızlı değişiklikleri içerebilir. Bu nedenle, stres sırasında bir RBP'nin rolünü gerçekten anlamak için, zamana bağlı analizler yapmak en iyisidir, çünkü stres sırasında RBP hedeflerinin tüm spektrumunu yakalayabilir ve seçilen RBP'nin stres tepkisinin hangi aşamasında aktif olduğunu belirleyebilirler. Özellikle, mayadaki çalışmalar, adaptasyonun ilk birkaç dakikasının hayatta kalmak için kesinlikle çok önemli olduğunu ve bakterilerdeki RNA yarı ömrünün dakikalardan saniyelere kadar değişebileceğini göstermiştir 29,30,31,32,33. Bu nedenle, bu tür zaman çözümlü analizler ideal olarak yüksek zamansal çözünürlükte yapılmalıdır. Bununla birlikte, uzun çapraz bağlama süreleri, erken aşama adaptif yanıtların incelenmesini özellikle zorlaştırmaktadır.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, yakın zamanda hücreleri dakikalarca süren zaman dilimlerinde çapraz bağlayabilen ve toplayabilen gelişmiş bir yöntem geliştirdik. χCRAC yöntemimiz, RBP-RNA etkileşimlerindeki dinamik değişikliklerin daha önce tanık olunmamış çözünürlükte nicel olarak ölçülmesini sağlar. Bu yöntem için çok önemli olan, çözeltideki maya ve bakterilerde gerekli çapraz bağlanma süresini yaklaşık 10 kat azaltan ve RBP-RNA etkileşimlerini anında etkili bir şekilde donduran yeni bir UV ışınlama cihazı32'nin geliştirilmesiydi. Ek olarak, UV ışınlamasından sonra hücreleri hızlı bir şekilde toplamak için, yaklaşık 30 s32'de 0.5 L'lik bir kültürde katlanarak büyüyen mayayı hasat edebilen bir vakum filtrasyon cihazı geliştirdik. Bu teknolojik yenilikler, RBP-RNA dinamiklerinin dakika ölçeğinde çözünürlükte incelenmesine izin verir. Ek olarak, pratikliğini artırmak için orijinal CRAC protokolü2'ye çeşitli optimizasyonlar da getirdik.
χCRAC kullanarak, yakın zamanda glikoz yoksunluğuna yanıt olarak bir maya nükleer RBP'si olan Nab3'ün hedefini inceledik. Saccharomyces cerevisiae'de Nab3, NNS kompleksini oluşturmak için Nrd1, bir RBP ve RNA helikaz Sen1 ile bir kompleks oluşturabilir. RNA polimerazına ve yeni ortaya çıkan transkripte NNS'nin bağlanması, transkripsiyonel sonlandırmayı tetikleyebilir34. Bu kompleks çoğunlukla şifreli kodlamayan RNA transkriptlerinin çıkarılmasında rol oynar, ancak protein kodlayan genlerin ekspresyonunu düzenlediği de gösterilmiştir. Çalışma, Nab3'ün sadece bir dakikalık stresten sonra kodlamayan ve kodlamayan transkriptlere diferansiyel hedeflemesini gösterdi32. Nab3 ile ko-transkripsiyonel sonlandırmanın, retrotranspozon genlerinin çok geçici, nabız benzeri bir ekspresyonu ile sonuçlandığını ve geleneksel CLIP tabanlı yaklaşımlar kullanılarak tespit edilmesinin zor olacağını gösterdik. Ek olarak, UV çapraz bağlayıcımızdaki kısa UV ışınlama süreleri, kısa ömürlü kodlamayan RNA'ların geri kazanımını da önemli ölçüde artırdı32. χCRAC muhtemelen RBP'lerin strese verilen tepkiyi anlık zaman ölçeklerinde nasıl şekillendirdiğini değil, aynı zamanda bir yanıtın tüm yaşam döngüsü boyunca değişen rollerini de aydınlatmada çok önemli bir araç olacaktır. Bu makale, χCRAC protokolündeki tüm adımlara ayrıntılı bir genel bakış sunmaktadır. Açıklayıcı amaçlar için, yöntem, transkripsiyonel sonlandırma ve RNA bozunumunda35,36 ile ilgili olan maya Nrd1 proteinini ve çok sayıda zaman noktasında glikoz yoksunluğuna yanıt olarak RNA hedefomunu incelemek için kullanıldı. Son olarak, UV ışınlama ünitemizin RBP'leri HeLa hücrelerinde RNA'ya hızlı bir şekilde çapraz bağlayabildiğini ve yapışkan hücrelerde yüksek çözünürlüklü zaman çözümlü analizler yapmayı mümkün kıldığını da gösteriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

RNA bağlayıcı proteinler (RBP'ler) ve RNA substratları arasındaki etkileşim, akışkanlık ve karmaşıklık gösterir. Yaşam süresi boyunca, tek bir RNA, üretimini, kararlılığını, aktivitesini ve bozulmasını düzenleyecek birçok farklı RBP tarafından bağlanabilir. Bu nedenle, bu iki molekül türü arasında var olan dinamikleri anlamak için çok şey yapılmıştır. Özellikle önemli bir atılım, 'cross-l mürekkepleme ve immunoprecipitation' (CLIP) ortaya çıkmasıyla geldi. Bu teknik, hangi RNA'ların belirli bir RBP tarafından bağlandığına dair sıkı bir araştırmaya izin verdi. Kısacası, ilgilenilen protein, RNA substratlarına in vivo olarak çapraz bağlanmış, oldukça katı koşullar altında saflaştırılmış UV'dir ve daha sonra proteine kovalent olarak çapraz bağlanmış RNA'lar cDNA kütüphanelerine dönüştürülür ve sıralanır. Kuruluşundan bu yana, CLIP'yi belirli çalışma alanlarına uygun hale getirmek için birçok türev teknik geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ultraviyole ışık kullanarak çapraz bağlama, bilinen bir şekilde verimsizdir. Bu, RBP-RNA etkileşimlerinin zamansal çalışmasını imkansız kılan uzun maruz kalma süreleri ile sonuçlanır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, yakın zamanda çok daha gelişmiş UV ışınlama ve hücre toplama cihazları tasarladık ve ürettik. Bu yeni araçları kullanarak, canlı hücrelerdeki RBP-RNA etkileşimlerinin yüksek zamansal çözünürlükte zamana bağlı analizleri için bir protokol geliştirdik: Kinetik CRoss bağlantısı ve cDNA'larının (χCRAC) birnalizi. Son zamanlarda bu tekniği, maya RBP'lerinin besin stresi adaptasyonundaki rolünü incelemek için kullandık. Bu makalede χCRAC yöntemine ayrıntılı bir genel bakış sunulmakta ve Nrd1 RBP ile elde edilen son sonuçlar sunulmaktadır.

χCRAC yönteminin etkinliğini göstermek için, HTP etiketli bir Nrd1 proteinini eksprese eden maya suşları ile bir zaman kursu deneyi yapıldı. Yöntemin nasıl çalıştığını açıklayan ayrıntılı bir şematik gösterim Şekil 1'de verilmiştir. Nab3 gibi, Nrd1 de çeşitli RNA transkriptlerinin nükleer RNA bozunumunda rol oynar37. Corden laboratuvarından yapılan önceki çalışmalar, RNA hedeflerine Nrd1 bağlanmasının, hücreler glikoz açlığına maruz kaldığında önemli ölçüde değiştiğini öne sürdü28,38. Bu nedenle, glikoz içeren ortamda (SD-TRP) katlanarak büyüyen hücreler, Nrd1-RNA etkileşimlerindeki dinamik değişiklikleri izlemek için bir zaman boyunca glikoz (S-TRP) olmadan aynı ortama kaydırıldı. Numuneler vardiyadan önce Vari-X-bağlayıcı odasında (Şekil 3A) alındı ve çapraz bağlandı ve daha sonra 1, 2, 4, 8, 14 ve 20 dakika sonra bağlandı. Hücre büyümesi için kullanılan ortam, bu aromatik amino asit tarafından UV emilimini azaltmak için triptofanda kasıtlı olarak eksikti. Filtreyle sterilize edilmiş sentetik ortamın kullanılmasının en iyisi olduğunu unutmayın, çünkü ortamın otoklavlanması şekerlerin karamelizasyonuna yol açabilir. Bu daha sonra çapraz bağlama verimliliğini azaltır.
Şekil 4A , χCRAC deneyinden temsili bir otoradyografi göstermektedir. Bu örnekte, örneklerin birlikte havuza alınmadığını unutmayın. Bunun yerine, her biri jel üzerinde ayrı ayrı çalıştırıldı. Bu, proteinin test edilen tüm zaman noktalarında RNA'ya etkili bir şekilde çapraz bağlandığını göstermek için ilk deneysel testler için önerilir. RBP'nin beklenen moleküler ağırlığında, dizileme için uygun olmayan çok kısa, radyoaktif işaretli RNA'lara bağlı proteini temsil eden özellikle yoğun bir sinyal gözlendi. Bu nedenle, daha uzun RNA fragmanlarına çapraz bağlanmış protein olan bu bandın üzerindeki yayma sinyali izole edildi. Parça, protein bandının hemen üstünden artı yaklaşık 30 kDa'dan kesildi. Şekil 4B , eksizyonu takiben bir otoradyogramı göstermektedir, protein jelde kalan kısa RNA'lara çapraz bağlanmıştır ve daha önce yayılmış olan sinyal şimdi eksize edilmiştir.
Ters transkripsiyondan sonra, cDNA kütüphanesi PCR kullanılarak güçlendirilmelidir. Bununla birlikte, kütüphanenin aşırı amplifikasyonundan kaçınılmalıdır, çünkü bu, polimeraz tarafından tercihen çoğaltılan dizilere karşı önyargı oluşturabilir ve PCR artefaktları üretebilir. Aşırı güçlendirilmiş kütüphaneler ayrıca sıralayıcıda okunan çok sayıda yinelenen dizi içerir. Son kütüphanenin amplifikasyonu için ideal PCR döngüsü sayısını hesaplamak için, cDNA'nın bir alikotu P5 ve BC oligonükleotidleri kullanılarak qPCR yoluyla büyütüldü. Kütüphanenin en yüksek floresana ulaştığı ilk döngü PCR döngü sayısı olarak seçildi. Şekil 4C , tipik bir cDNA kütüphanesinden 16'lık bir tepe döngüsü sayısı veren bir qPCR örneği vermektedir. Bu değer daha sonra son χCRAC PCR için kullanıldı. Sıralanan verileri işlemek için, daha önce laboratuvarımızda geliştirilen yazılımı (pyCRAC) ve kinetik CRAC verilerinin analizi için ilgili boru hattını kullandık (Nues ve ark., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Bu açık kaynaklı yazılım araçları, verilerin çoğullanmasının çözülmesini ve kırpılmasını, PCR kopyalarının kaldırılmasını, istatistiksel olarak anlamlı tepe noktalarının tanımlanmasını, kümenin bitişik dizilere okunmasını ve bağlanma motiflerinin tanımlanmasını sağlar39. Bu araçların nasıl çalıştığına dair daha fazla ayrıntı ilgili web sayfalarında bulunabilir.
Ayrıca memeli hücreleri için bir χCRAC protokolü geliştirmeye başladık. Memeli hücre hatlarının çoğunluğu tek katmanlı olarak yetiştirilir ve UV geçirgen torba ile çapraz bağlayıcımızdaki tepsi, yapışkan hücrelerle yapılan deneyler için uygun değildir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, kullanıcıların 1-2 Petri kabını (150 mm çapında ve 25 mm derinliğinde) yapışkan hücrelerle UV ışınlayabilecekleri bir aşama geliştirdik (Şekil 3B). İlk test olarak, memeli hücreleri için çapraz bağlayıcının etkinliği, anti-GFP antikorları ve geleneksel bir CLIP tabanlı saflaştırma kullanılarak çapraz bağlanma ve kararlı şekilde etiketlenmiş GFP-RBM7'nin yakalanması yoluyla ölçülmüştür. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, çapraz bağlayıcı, yaygın olarak kullanılan bir UV ışınlama cihazıyla karşılaştırılabilir verimliliklerde 254 nm UV ışınlaması kullanarak tek katmanlı olarak yetiştirilen memeli hücrelerinden protein-RNA komplekslerini geri kazanabildi. Bununla birlikte, normalde UV çapraz bağlama deneyleri için kullanılan standart hücre kültürü plastik eşyaları 254 nm UV'ye kadar geçilemez. Bu nedenle, çapraz bağlayıcımızda hücreler sadece UV lambalarının üst bankasından ışınlama alacaktır. Bunun üstesinden gelmek için, hücre büyümesi ve çapraz bağlanma için UV geçirgen bir kuvars Petri kabı geliştirdik. Kuvars kültür kaplarının kullanımı, 2 s kadar az UV ışınlaması ile protein-RNA komplekslerinin sağlam bir şekilde geri kazanıldığını göstermiştir (Şekil 5B). CLIP teknolojileri gibi memeli hücreleri için RBP yakalama yöntemleriyle birleştirildiğinde, bu kısa çapraz bağlama süreleri, genotoksik streslere veya protein faktörlerinin hızlı tükenmesine yanıt olarak veya transkripsiyonel veya hücre döngüsü senkronizasyonuna paralel olarak RBP'lerin mekansal zamansal RNA bağlanma profillerini geri kazanmak için zaman dilimleriyle uyumludur.
Şekil 6'da , χCRAC işlem hattı tarafından işlenen Nrd1 verilerinin birkaç örneği gösterilmektedir. Bu şekil, işlem hattı tarafından oluşturulan yatak grafiği dosyaları ve verilerin yayın kalitesinde genom tarayıcı görüntülerini oluşturmayı basitleştirmek için tasarladığımız python GenomeBrowser paketi (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/) kullanılarak hazırlanmıştır. Gri dikdörtgenler, şifreli kararsız transkript (CUT'lar), kararlı karakterize edilmemiş transkriptler (SUT'ler)40 ve Xrn1'e duyarlı kararsız transkriptler (XUT'lar)41 gibi kodlamayan RNA'ları ifade eden genomik bölgeleri temsil eder. Şekil 6'daki veriler, Nrd1'in bu kodlamayan RNA transkriptlerinin çoğuna bağlandığını ve bu proteinin bu transkript sınıfının42 sınıfının bozulmasında rol oynadığı fikriyle tutarlı olduğunu göstermektedir. Şekil 6A , kromozom IV üzerinde ~ 15 kb'lik bir bölgeyi göstermektedir. Burada, Nrd1'in, her ikisi de glikoz açlığı sırasında yukarı regüle edilen yüksek afiniteli glikoz taşıyıcıları HXT6 ve HXT7'yi kodlayan transkriptlere bağlanmasında önemli bir artış olmuştur. NNS kompleksi tarafından transkripsiyon sonlanmasının, glikoz açlığı sırasında bu genlerin indüksiyon kinetiğini etkilemesi muhtemeldir. Şekil 6B , Nab343 tarafından düzenlendiği bilinen Imd3 transkriptine Nrd1 çapraz bağlama örneğini göstermektedir. Bu durumda, veriler glikoz açlığına bağlanmada önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Önceki çalışmalar, glukoz açlığı44 sırasında Nab3'ün Tye7 transkriptine bağlanmasının azaldığını göstermiştir. Bu gözlemle tutarlı olarak, χCRAC verileri, glikoz açlığı sırasında Nrd1'in bağlanmasının azaldığını ve Nrd1'in Tye7'ye çapraz bağlanmasının 8 dakikalık stresten sonra en düşük seviyede olduğunu göstermektedir (Şekil 4C). Bununla birlikte, bu etkinin sadece geçici olduğu görülmektedir, çünkü 14 dakikalık glikoz açlığından sonra, Nrd1 bağlanması başlangıç seviyelerine geri dönmüştür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Şekil 1: χCRAC protokolünün şematik gösterimi. Etiketli suşlar istenen yoğunluğa kadar yetiştirildi. RBP, RNA bağlayıcı proteini gösterir. Daha sonra bir referans numune alındı ve 254 nm UV ışığı ile çapraz bağlandı. Kalan hücreler filtrasyon yoluyla toplandı ve daha sonra hızla strese neden olan ortama kaydırıldı. Burada açıklanan χCRAC deneyi için, örnekler alındı ve vardiyadan 1, 2, 4, 8, 14 ve 20 dakika sonra çapraz bağlandı (1). İlgilenilen RBP daha sonra son derece katı iki adımlı bir afinite saflaştırması kullanılarak saflaştırıldı (2). Daha sonra, yakalanan çapraz bağlı RNA'lar kısmen RNazlarla sindirildi, 5' ucunda radyo-etiketli ve adaptörler üzerlerine bağlandı (3). 5' adaptörler benzersiz "okunan" barkod dizileri içeriyordu, böylece tek tek numuneler sıralamadan sonra biyoinformatik olarak ayrılabiliyordu. RBP-RNA kompleksleri daha sonra salınım, havuzlanmış ve birlikte çökeltilmiş (4), SDS-PAGE ile çözülmüş ve otoradyografi ile görselleştirilmiştir (5). Daha sonra, otoradyografi görüntüsünde kesikli kırmızı kutu ile gösterilen, ana bandın hemen üzerindeki radyoaktif sinyali içeren tek bir jel dilimi jelden kesildi (5). Jel dilimleri proteaz K ile muamele edildi ve RNA daha sonra ekstrakte edildi (6), cDNA'lara dönüştürüldü ve PCR (7) ile güçlendirildi. PCR adımı, birçok kütüphanenin tek bir şeride çoğaltılabilmesi için ek barkodlar (P7 oligo tarafından tanıtılan sarı blok) getirdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Şekil 2: Çapraz bağlama ve vakum filtreleme. (A) Çapraz bağlayıcı. Hücre süspansiyonu, makinenin sağ üst köşesinde bulunan bir huniye dökülür (yakın çekim için ayrıca Şekil 3A'ya bakınız) ve orta tepside bulunan UV şeffaf bir torbada tutulur. Bu torba, kullanıcı makineye ışınlama adımını başlatması talimatını verene kadar kapalı kalan iki panjurla çevrilidir. Hücreler hem yukarıdaki hem de aşağıdaki tepsilerden UV ışığı ile ışınlanır. Makine 254 ve 365 nm UV lambalarla birlikte gelir, ikincisi PAR-CLIP deneyleri için geçerlidir. Makine, sağ üstte bulunan ve UV dozajını veya maruz kalma süresini kontrol etmeyi sağlayan dokunmatik bir panelden çalıştırılır. (B) Çapraz bağlamayı takiben, hücreler makinenin sol tarafından boşaltılır. Hücre süspansiyonları vakum yoluyla geri kazanılır ve daha sonra hasat için bir vakum filtreleme cihazına dökülebilecekleri bir cam şişeye boşaltılır. (C) Vakum filtrasyon cihazları. Bunlar bir klips aracılığıyla açılıp kapatılır ve arasına bir filtre yerleştirilir. Filtrelerin değiştirilmesi sonucu hiç zaman kaybetmemek için çok kısa süreli seriler için dört filtreleme cihazı paralel olarak kullanılmıştır. (D) Filtrelemeyi takiben, ortam süpernatantı daha sonra imha edilmek üzere şişelere boşaltıldı. Filtre çıkarıldığında sistemdeki vakumu korumak için vakum filtrasyon cihazlarının altına vanalar monte edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Şekil 3: Çapraz bağlama askıya alınmış ve yapışkan hücreler. (A) Süspansiyon hücreleri için Vari-X-bağlayıcı hazneli çapraz bağlayıcı. Hücre kültürü, tepsinin sağ üst köşesinde bulunan numune girişine (huni) dökülür. (B) Yapışkan hücreleri veya küçük hacimli süspansiyon hücrelerini çapraz bağlamak için plastik veya kuvars Petri kaplarını tutabilen tepsi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Şekil 4: Kütüphane hazırlığı. (A) Nrd1-HTP χCRAC deneyinden bir otoradyogram örneği. Güçlü, konsantre sinyal, çok kısa RNA'lara çapraz bağlanmış proteini temsil ederken, yukarıdaki yayma, dizileme için yeterli uzunluktaki RNA'lara çapraz bağlanmış proteini temsil eder. (B) Yayma, jel eksizyonundan sonra alınan bir otoradyogramda gösterildiği gibi eksize edildi. (C) χCRAC cDNA kütüphanesinden temsili bir qPCR. Bu örnekte, cDNA'nın maksimum amplifikasyonuna 16 döngüde ulaşılmıştır. Böylece, son amplifikasyon için 16 döngü kullanıldı. Hata çubuğu, üç teknik qPCR çoğaltmasının standart sapmasını temsil eder. (D) %6 TBE jeli üzerindeki bir cDNA kütüphanesinden fosfor görüntüsü örneği. (E) Çip bazlı kılcal elektroforezden cDNA uzunluğu ve kalite analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Şekil 5: Memeli hücrelerinde çapraz bağlanmayı test etmek için yüksek RNaz testi iCLIP deneyi. GFP-RBM7 iCLIP deneylerinden elde edilen otoradyogramlar, çeşitli çapraz bağlama enerjilerinde RNP geri kazanımının verimliliğini test etmiştir. İmmünopresipitasyonlar, GFP-RBM7'yi kararlı bir şekilde eksprese eden çapraz bağlı hücreler üzerindeki manyetik boncuklara bağlı anti-GFP antikorları kullanılarak gerçekleştirildi. İmmünoçökeltiler, ilişkili RNA'ları kısa, düzgün uzunluklara kırpmak için yüksek konsantrasyonlarda RNaz I ile inkübe edildi. RNP'ler 32P etiketleme ve SDS-PAGE ile görselleştirildi ve çapraz bağlı olmayan proteinin göçüne yakın, tanımlanmış bir bant olarak göç etti. Niceliklendirme, anti-GFP batı leke sinyaline normalleştirilmiş radyoaktif işaretli RBM7-RNA sinyalinin densitometrik analizlerinin sonuçlarını gösterir. (A) Yaygın olarak kullanılan UVP çapraz bağlayıcısının çapraz bağlayıcı ile çapraz bağlayıcı zaman seyri (Vari-X-bağlayıcı; VxL). (B) Kuvars (solda) ve plastik (sağda) kültür gereçleri üzerindeki çapraz bağlayıcımızın çapraz bağlama zaman seyri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Şekil 6: χCRAC'ın Nrd1'in hedeflerine diferansiyel, zamansal bağlanmasını gösterme gücünü gösteren örnek genom tarayıcı grafikleri. Her kutu ayrı genomik bölgeler için grafikler gösterir. Oklar, genlerin hangi iplikçikte kodlandığını gösterir (sola işaret eden ok = eksi iplikçik; sağa işaret eden ok = artı iplikçik). Zaman noktaları (dk), her bir alt grafiğin y eksenlerinde t0, t1, t2 vb. İle gösterilir. Kromozomları ve koordinatları gösteren Romen rakamları gösterilir. (A) Glikoz yoksunluğu üzerine, Nrd1, her ikisi de bu durumda yukarı regüle edilen iki yüksek afiniteli glikoz taşıyıcısını, HXT6 ve HXT7'yi bağlar. (B) Nrd1'in, Nab344'ün zaten doğrulanmış bir hedefi olan Imd3'e bağlandığı ve glikoz açlığını takiben yoğunluğun azaldığı gözlenmiştir. (C) Tye7'nin Nrd1 bağlanması dinamik ve geçici bir nitelik sergiler, glikoz açlığından sonra 8 dakikalık stresten sonra minimuma iner. Bununla birlikte, bağlanma daha sonra 14 dakika sonra bazal seviyelere geri döner. Okumalar "milyonda okuma" (RPM; y ekseni) olarak normalleştirildi. Gri kutular, kodlamayan RNA'ları kodlayan bölgeleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

monitoring-protein-rna-interaction-dynamics-vivo-at-high-temporal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K Görüntüleme.  University of Edinburgh. cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Video: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) data. The protocol presented here describes in detail how to obtain a near-atomic resolution structure starting from cryo-EM micrograph movies by guiding users through all steps of the single particle structure determination pipeline. These steps are controlled from the new SPHIRE graphical user interface and require minimum user intervention. Using this protocol, a 3.5 &#197; structure of TcdA1, a Tc toxin complex from Photorhabdus luminescens, was derived from only 9500 single particles. This streamlined approach will help novice users without extensive processing experience and a priori structural information, to obtain noise-free and unbiased atomic models of their purified macromolecular complexes in their native state.

This paper presents a protocol for processing cryo-EM images using the software suite SPHIRE. The present protocol can be applied for nearly all single particle EM projects that target near-atomic resolution.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Biyokimya

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.