Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des Wellcome Trust (091549 an S.G und 109093/Z/15/A an S.M.), des Wellcome Trust Centre for Cell Biology Core Grant (092076) und des Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 an S.G.), der European Molecular Biology Organization im Rahmen eines langfristigen Postdoc-Stipendiums (ALTF 1070-2017 an R.A.C.), und dem Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

A. Langford und W. Worboys sind mit UVO3, einem Handelsunternehmen, verbunden. Sie spielten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datenerhebung und -interpretation oder bei der Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.

Die χCRAC-Methode hat in Kombination mit den neuen Vernetzungs- und Zellerntegeräten ein großes Potenzial, da sie auf ein breites Spektrum von Modellorganismen anwendbar ist und daher für das RNA-Feld von allgemeinem Interesse sein sollte. Es gibt viele Bereiche, in denen χCRAC eingesetzt werden kann. Mit der Methode ließe sich beispielsweise die hierarchische Anordnung von Proteinen zu großen makromolekularen Komplexen wie dem Spleißosom und dem Ribosom messen, bei der es häufig zu dynamischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und RNA-Molekülen kommt. Wir verwenden es jetzt auch routinemäßig, um Wechselwirkungen zwischen RNA-Zerfallsfaktoren und ihren Substraten zu überwachen, wenn Zellen verschiedenen Arten von Stress ausgesetzt sind. Auf diese Weise können wir bestimmen, in welchem Stadium der adaptiven Reaktion diese Faktoren am aktivsten sind, an welche Substrate sie binden und wie dynamisch diese Wechselwirkungen sind. Solche Daten sollen es den Forschern ermöglichen, den relativen Beitrag jedes Faktors zur Anpassung an Umweltveränderungen zu bestimmen.
χCRAC verwendet duale Affinitätsreinigungs-Tags (HTF oder HTP), um das Protein unter hochstringenten und denaturierenden Bedingungen zu reinigen. Dadurch wird sichergestellt, dass die kogereinigte RNA stark für RNAs angereichert ist, die kovalent mit dem interessierenden Protein vernetzt waren. Die Verwendung von Affinitätstags hat jedoch Nachteile. Zum Beispiel könnte der Tag die Funktion des Proteins stören, was zu einem verzerrten Auslesen seines RNA-bindenden Interaktoms führen könnte. Darüber hinaus ist es für einige Modellorganismen möglicherweise nicht immer möglich, Tags zu verwenden, da die genetischen Werkzeuge zur Integration von DNA-Fragmenten in das Genom oder zur Transformation von Expressionsplasmiden noch nicht verfügbar sind. Es ist jedoch einfach, einige Teile des χCRAC-Protokolls zu ändern, um es mit CLIP-basierten Protokollen kompatibel zu machen, die auf Antikörper zur Aufreinigung des RBP angewiesen sind. Tatsächlich hat diese Studie gezeigt, dass es möglich ist, iCLIP-basierte Reinigungen mit unserem Vernetzer zu kombinieren. Wir sind gerade dabei, CLIP-Protokolle zu entwickeln, um die zeitliche Assoziation von humanen RNA-bindenden Proteinen mit entstehenden RNA-Transkripten zu untersuchen.
Bei der Durchführung von χCRAC an einem neuen Protein muss die UV-Belichtung optimiert werden, um eine maximale Vernetzung zu induzieren. Dies ist wichtig, da hohe UV-Strahlen die Rückgewinnung von RNA während des Aufreinigungsschritts verringern können. Zellen, die das rekombinante RBP exprimierten, wurden verschiedenen UV-Dosen ausgesetzt: 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 und 1 J/cm2. Anschließend wurden die RNPs eingefangen und die RNAs fragmentiert und radioaktiv markiert. Anschließend wurden die RNPs mittels SDS-PAGE aufgelöst und ein Autoradiogramm erstellt, um daraus abzuleiten, welche Belichtung das intensivste Signal lieferte (d.h. die maximale Vernetzung).
Sobald die Versuchsbedingungen optimiert sind, werden bei der Durchführung von χCRAC mehrere Kontrollexperimente empfohlen. Zunächst kann eine UV-bestrahlte, nicht markierte Probe verwendet werden, um die Hintergrundbindung an die Reinigungsperlen zu überwachen. Zweitens ermöglicht eine zweite Zeitreihe, in der die Zellen in das ursprüngliche Medium zurückverschoben werden, bei der Anwendung von χCRAC während eines Shift-Experiments untersucht, ob die Filtration der Zellen selbst Veränderungen des RNA-Niveaus oder Protein-RNA-Interaktionen induziert.
Wie in der Einleitung erwähnt, schlagen zahlreiche kürzlich veröffentlichte Arbeiten eine Reihe von Optimierungen des CLIP-Protokolls vor. Dies schließt die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Adaptern zur Detektion des Protein-RNA-Komplexes durch Infrarot-Abtastung10 sowie Optimierungen an verschiedenen Nukleinsäurereinigungs- und Größenauswahlschritten ein, die die Komplexität der resultierenden Bibliotheken 12,45 erhöhen. Wir implementieren derzeit einige dieser Verbesserungen, um das χCRAC-Protokoll weiter zu verfeinern. Das hier vorgestellte Protokoll enthält bereits eine Reihe von Verbesserungen gegenüber den ursprünglichen CRAC- und χCRAC-Protokollen, die die Komplexität der Daten erhöhen. Zuvor wurden beispielsweise die vernetzten, radioaktiven Protein-RNA-Komplexe auf SDS-PAGE-Gelen nach der Auflösung auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und die vernetzte RNA aus dem Blot isoliert. Der Transfer des RNP und die anschließende RNA-Extraktion können jedoch sehr ineffizient sein, insbesondere wenn es sich um große RBPs wie RNA-Polymerase-Untereinheiten handelt. Dies kann zu einer deutlichen Verringerung der Rückgewinnung der vernetzten RNA führen. Im aktuellen Protokoll wird die vernetzte RNA direkt aus SDS-PAGE-Gelschnitten extrahiert, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies erhöhte die Rückgewinnung von vernetzten RNAs. Zusätzlich wurde das Produkt nach PCR-Amplifikation der cDNAs ursprünglich auf 3%-Agarosegele mit niedriger Schmelztemperatur aufgelöst und anschließend 175–300 bp PCR-Produkte aus dem Gel extrahiert. Diese Gele können jedoch leicht überladen werden, was zu einer sehr schlechten Trennung der DNA führt. Der Ersatz von Agarosegelen durch vorgefertigte FSME-Gele führte zu einer gleichmäßigeren Größentrennung und einer besseren Rückgewinnung von PCR-Produkten.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNAs sind oft auf RBPs angewiesen, um ihre Funktion auszuüben, was zu einem großen Interesse am Verständnis der Dynamik zwischen diesen Molekülen geführt hat. Viele RBPs wurden in einer Vielzahl von Organismen identifiziert. Es war jedoch schon immer bekanntermaßen schwierig, RBP-RNA-Interaktionen in vivo zu untersuchen. Ein großer Durchbruch bei der Untersuchung solcher Wechselwirkungen kam mit dem Aufkommen von CLIP1. Diese Methode nutzt ultraviolette (UV, 254 nm) Bestrahlung, um kovalente Bindungen zwischen RBPs und ihren direkt gebundenen RNAs zu induzieren (d. h. Quervernetzung ohne Abstand). Anschließend wird das zu untersuchende RBP unter strengen Bedingungen immungereinigt, um sicherzustellen, dass nur RNAs identifiziert werden, die kovalent mit den Proteinen vernetzt sind. Gebundene RNAs werden dann teilweise mit RNasen verdaut und anschließend zur Sequenzierung in cDNA-Bibliotheken umgewandelt. Die hohe Aufreinigungsstringenz ist wichtig, da sie die Spezifität der Protein- und RNA-Rückgewinnung erheblich erhöht, was auch durch die SDS-PAGE-Aufreinigung des vernetzten Ribonukleoprotein-Komplexes (RNP) weiter verbessert wird. CLIP und verwandte Methoden liefern auch Einblicke in die Nukleotidauflösung der Proteinbindungsstelle, da während der Herstellung der Sequenzierungsbibliothek Aminosäuren, die mit der RNA vernetzt sind, häufig die reverse Transkriptase beenden oder das Enzym veranlassen, Mutationen an dieser Stelle einzuführen 1,2,3.
Seit seiner Einführung hat das ursprüngliche CLIP-Protokoll eine bemerkenswerte Vielfalt an abgeleiteten Methoden hervorgebracht. Ein besonders wichtiger Durchbruch war die Entwicklung von HITS-CLIP (oder CLIP-seq), das die Hochdurchsatzsequenzierung mit dem CLIP-Ansatz3 verbindet. Dies wurde seither von allen CLIP-basierten Methoden übernommen. iCLIP führte Verbesserungen in den RNase-vermittelten Trimm- und Adaptorligationstechniken ein, die eine genauere Kartierung der RBP-Bindungsstellen ermöglichen4. PAR-CLIP kombinierte die 4thio-uridin/Uracil-Markierung mit der Vernetzung bei 365 nm und ermöglichte so die Kartierung von Vernetzungsstellen durch die Analyse von T-C-Substitutionen5. CRAC, Urea-iCLIP, dCLIP und uvCLAP führten Denaturierungsbedingungen und duale Affinitätsreinigungsschritte ein, die die Hintergrundbindung an das Affinitätsharz weiter reduzieren und die Spezifität des Proteineinfangs weiter erhöhen 2,6,7,8,9. Darüber hinaus führten CRAC, uvCLAP und dCLIP die Markierung des interessierenden RBP mit einem Affinitäts-Tag ein, wodurch die Notwendigkeit der Generierung spezifischer Antikörper überwunden wurde.
Es wurden auch mehrere Optimierungen vorgenommen, um die CLIP-Methodik zu beschleunigen. Das ursprüngliche CLIP-Protokoll nutzte die radioaktive Markierung der gefangenen RNAs, um die RBP-RNA-Komplexe nach SDS-PAGE sichtbar zu machen. Der Einsatz von Radioaktivität kann jedoch für Laboratorien, die nicht für solche Arbeiten eingerichtet sind, problematisch sein. irCLIP enthält einen Fluorophor-gekoppelten Adapter, der die Visualisierung durch Infrarot-Bildgebung10 erleichtert, und sCLIP nutzt die Biotinylierung von eingefangenen RNAs, um sie durch Streptavidin-konjugiertes HRP11 zu visualisieren. Darüber hinaus verzichtet eCLIP komplett auf die RNA-Markierung; Stattdessen wird das Protein allein aufgrund seiner bekannten Größe12 herausgeschnitten. Die Streptavidin-basierte Aufreinigung wurde auch verwendet, um den Prozess der Bibliotheksvorbereitung in FAST-iCLIP zu beschleunigen, bei dem ein biotinylierter 3'-Adapter auf die RNAs ligiert und verwendet wird, um die Aufreinigung nach reverser Transkription und Zirkularisierung zu ermöglichen13. Zusätzliche Erweiterungen des iCLIP-Protokolls erhöhten auch die Komplexität der Bibliothekenerheblich 4.
Schließlich wurde CLIP modifiziert, um das Einfangen von RBPs aus verschiedenen zellulären Subkompartimenten zu ermöglichen 14,15, um neu transkribierte RNAs durch gepulste Induktion der photoaktivierbaren Ribonukleoside 5,16,17 sichtbar zu machen, um methylierte RNAseinzufangen 18,19,20, um RNA-RNA-Interaktionen 21,22 zu untersuchen und um 3'-Enden zu kartieren 23,24.
Trotz des großen Beitrags von CLIP-basierten Techniken zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen RBPs und RNAs wurde dies durch die Ineffizienz der UV-Vernetzung eingeschränkt. Während in einer Monoschicht gezüchtete Kulturzellen in der Regel relativ einfach zu vernetzen sind, ist dies in Geweben oder Zellen in Lösung deutlich schwieriger. Gewebe kann mehrere Runden UV-Bestrahlung erfordern, um in die erforderlichen Zellschichten einzudringen, während mikrobielle Zellen oft in reichhaltigen Medien gezüchtet werden, die aromatische, UV-absorbierende Verbindungen enthalten25. Tatsächlich wurden UV-Bestrahlungszeiten von bis zu 30 Minuten verwendet, um eine ausreichende Vernetzung zwischen RBPs und ihren gebundenen RNAs für solche Proben zu erzeugen26,27,28. Diese ausgedehnte UV-Exposition induziert Stressreaktionen innerhalb der Zelle, wie z. B. UV-induzierte DNA-Schäden, die in einigen Anwendungen die endgültigen Daten kontaminieren können.
Die Mehrzahl der CLIP-Studien konzentrierte sich auf die Erstellung einzelner "Momentaufnahmen" spezifischer Protein-RNA-Interaktionen in einer Zelle. Protein-RNA-Interaktionen sind jedoch von Natur aus dynamisch, insbesondere wenn Zellen Veränderungen in ihrer Umgebung unterliegen. Dies kann eine plötzliche Verringerung der Verfügbarkeit von essentiellen Nährstoffen oder schnelle Temperaturänderungen umfassen. Um die Rolle eines RBP während Stress wirklich zu verstehen, ist es daher am besten, zeitaufgelöste Analysen durchzuführen, da sie das gesamte Spektrum der RBP-Ziele während des Stresses erfassen und bestimmen können, in welchem Stadium der Stressantwort das gewählte RBP aktiv ist. Insbesondere Studien an Hefen zeigten, dass die ersten Minuten der Anpassung absolut überlebenswichtig sind und die RNA-Halbwertszeiten in Bakterien von Minuten bis Sekunden variieren können 29,30,31,32,33. Daher sollten solche zeitaufgelösten Analysen idealerweise mit hoher zeitlicher Auflösung durchgeführt werden. Die langen Vernetzungszeiten machen es jedoch besonders schwierig, adaptive Reaktionen im Frühstadium zu untersuchen.
Um diese Probleme zu lösen, haben wir kürzlich eine verbesserte Methode entwickelt, die in der Lage ist, Zellen auf winzigen Zeitskalen zu vernetzen und zu ernten. Unsere χCRAC-Methode ermöglicht die quantitative Messung dynamischer Änderungen in RBP-RNA-Wechselwirkungen mit bisher unerreichter Auflösung. Entscheidend für dieses Verfahren war die Entwicklung einer neuartigen UV-Bestrahlungsvorrichtung32 , die die erforderliche Vernetzungszeit in Hefen und Bakterien in Lösung um das 10-fache reduziert, wodurch RBP-RNA-Wechselwirkungen sofort effektiv eingefroren werden. Um die Zellen nach UV-Bestrahlung schnell zu ernten, haben wir außerdem ein Vakuumfiltrationsgerät entwickelt, das exponentiell wachsende Hefe in einer 0,5-Liter-Kultur in etwa 30 s32 ernten kann. Diese technologischen Innovationen ermöglichen die Untersuchung der RBP-RNA-Dynamik mit einer Auflösung im Minutenbereich. Darüber hinaus haben wir auch mehrere Optimierungen am ursprünglichen CRAC-Protokoll2 vorgenommen, um seine Praktikabilität zu erhöhen.
Mit χCRAC haben wir kürzlich das Targetom eines Hefekern-RBP, Nab3, als Reaktion auf Glukoseentzug untersucht. In Saccharomyces cerevisiae kann Nab3 einen Komplex mit Nrd1, einem RBP und der RNA-Helikase Sen1 bilden, um den NNS-Komplex zu bilden. Die Bindung von NNS an die RNA-Polymerase und das entstehende Transkript kann eine transkriptionelle Terminierung auslösen34. Dieser Komplex ist hauptsächlich an der Entfernung kryptischer, nicht-kodierender RNA-Transkripte beteiligt, reguliert aber auch die Expression proteinkodierender Gene. Die Studie zeigte ein differentielles Targeting von Nab3 auf nicht-kodierende und kodierende Transkripte nach nur einer Minute Stress32. Wir konnten zeigen, dass die co-transkriptionelle Terminierung durch Nab3 zu einer sehr transienten, pulsartigen Expression von Retrotransposon-Genen führt, die mit herkömmlichen CLIP-basierten Ansätzen nur schwer zu detektieren gewesen wäre. Darüber hinaus erhöhten die kurzen UV-Bestrahlungszeiten in unserem UV-Vernetzer auch die Rückgewinnung kurzlebiger nicht-kodierender RNAssignifikant 32. χCRAC wird wahrscheinlich ein entscheidendes Instrument sein, um nicht nur zu verdeutlichen, wie RBPs die Reaktion auf Stress auf unmittelbaren Zeitskalen gestalten, sondern auch ihre sich ändernden Rollen während des gesamten Lebenszyklus einer Reaktion. Dieses Manuskript bietet einen detaillierten Überblick über alle Schritte des χCRAC-Protokolls. Zur Veranschaulichung wurde die Methode verwendet, um das Hefeprotein Nrd1, das an der transkriptionellen Terminierung und dem RNA-Zerfall beteiligt ist35,36, und sein RNA-Targetom als Reaktion auf Glukoseentzug über eine Vielzahl von Zeitpunkten hinweg zu untersuchen. Schließlich zeigen wir auch, dass unsere UV-Bestrahlungseinheit RBPs schnell mit RNA in HeLa-Zellen vernetzen kann, wodurch es möglich ist, auch hochauflösende zeitaufgelöste Analysen in adhärenten Zellen durchzuführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

Die Interaktion zwischen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und ihren RNA-Substraten weist Fluidität und Komplexität auf. Innerhalb ihrer Lebensdauer kann eine einzelne RNA von vielen verschiedenen RBPs gebunden werden, die ihre Produktion, Stabilität, Aktivität und ihren Abbau regulieren. Daher wurde viel getan, um die Dynamik zu verstehen, die zwischen diesen beiden Arten von Molekülen besteht. Ein besonders wichtiger Durchbruch kam mit dem Aufkommen der "c ross-linking and immunoprecipitation" (CLIP). Diese Technik ermöglichte eine stringente Untersuchung, welche RNAs an ein bestimmtes RBP gebunden sind. Kurz gesagt, das zu untersuchende Protein wird in vivo mit seinen RNA-Substraten UV-vernetzt, unter sehr strengen Bedingungen gereinigt und dann werden die kovalent mit dem Protein vernetzten RNAs in cDNA-Bibliotheken umgewandelt und sequenziert. Seit seiner Konzeption wurden viele abgeleitete Techniken entwickelt, um CLIP für bestimmte Studienbereiche zugänglich zu machen. Die Vernetzung mit ultraviolettem Licht ist jedoch notorisch ineffizient. Dies führt zu verlängerten Expositionszeiten, die eine zeitliche Untersuchung von RBP-RNA-Interaktionen unmöglich machen. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich stark verbesserte UV-Bestrahlungs- und Zellerntegeräte entwickelt und gebaut. Mit diesen neuen Werkzeugen haben wir ein Protokoll für zeitaufgelöste Analysen von RBP-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung entwickelt: Kinetic CRoss-linking und Analysis of cDNAs (χCRAC). Wir haben diese Technik kürzlich verwendet, um die Rolle von Hefe-RBPs bei der Anpassung an Nährstoffstress zu untersuchen. Dieses Manuskript gibt einen detaillierten Überblick über die χCRAC-Methode und präsentiert die jüngsten Ergebnisse, die mit dem Nrd1 RBP erzielt wurden.

Um die Wirksamkeit der χCRAC-Methode zu demonstrieren, wurde ein Zeitverlaufsexperiment mit Hefestämmen durchgeführt, die ein HTP-markiertes Nrd1-Protein exprimieren. Eine detaillierte schematische Darstellung, die die Funktionsweise des Verfahrens beschreibt, ist in Abbildung 1 dargestellt. Wie Nab3 ist auch Nrd1 am Zerfall der nukleären RNA einer Vielzahl von RNA-Transkripten beteiligt37. Frühere Arbeiten aus dem Corden-Labor deuteten darauf hin, dass sich die Bindung von Nrd1 an seine RNA-Ziele signifikant ändert, wenn Zellen einem Glukosemangel ausgesetzt sind28,38. Daher wurden Zellen, die exponentiell in glukosehaltigem Medium (SD-TRP) wuchsen, über einen bestimmten Zeitverlauf in dasselbe Medium ohne Glukose (S-TRP) verschoben, um dynamische Veränderungen in den Nrd1-RNA-Interaktionen zu beobachten. Die Proben wurden in der Vari-X-Linkerkammer (Abbildung 3A) vor der Schicht und dann nach 1, 2, 4, 8, 14 und 20 min entnommen und vernetzt. Das für das Zellwachstum verwendete Medium enthielt absichtlich einen Mangel an Tryptophan, um die UV-Absorption durch diese aromatische Aminosäure zu reduzieren. Beachten Sie, dass es am besten ist, synthetisches Medium zu verwenden, das filtersterilisiert ist, da das Autoklavieren des Mediums zu einer Karamellisierung des Zuckers führen kann. Dies verringert dann die Vernetzungseffizienz.
Abbildung 4A zeigt eine repräsentative Autoröntgenaufnahme aus einem χCRAC-Experiment. Beachten Sie, dass in diesem Beispiel die Stichproben nicht zusammengefasst wurden. Stattdessen wurde jeder einzeln auf dem Gel ausgeführt. Dies wird für erste experimentelle Tests empfohlen, um zu zeigen, dass das Protein zu allen getesteten Zeitpunkten effektiv mit RNA vernetzt. Ein besonders intensives Signal wurde beim erwarteten Molekulargewicht des RBP beobachtet, das das Protein repräsentiert, das an sehr kurze, radioaktiv markierte RNAs gebunden ist, die nicht für eine Sequenzierung geeignet sind. Dazu wurde das Schmiersignal oberhalb dieser Bande, das mit längeren RNA-Fragmenten vernetzt ist, isoliert. Das Fragment wurde knapp oberhalb der Proteinbande plus etwa 30 kDa geschnitten. Abbildung 4B zeigt ein Autoradiogramm nach der Exzision, bei dem das Protein mit kurzen RNAs vernetzt ist, die im Gel verbleiben, und das zuvor abstrichige Signal nun herausgeschnitten wird.
Nach der reversen Transkription muss die cDNA-Bibliothek mittels PCR amplifiziert werden. Eine Überamplifikation der Bibliothek muss jedoch vermieden werden, da dies zu einer Verzerrung gegenüber Sequenzen führen kann, die bevorzugt von der Polymerase amplifiziert werden, und PCR-Artefakte erzeugen kann. Überverstärkte Bibliotheken enthalten auch eine große Anzahl doppelter Sequenzen, die Lesevorgänge auf dem Sequenzer verschwenden. Um die ideale Anzahl von PCR-Zyklen für die Amplifikation der finalen Bibliothek zu berechnen, wurde ein aliquoter Teil der cDNA mittels qPCR mit den P5- und BC-Oligonukleotiden amplifiziert. Der erste Zyklus, bei dem die Bibliothek den Höhepunkt der Fluoreszenz erreichte, wurde als PCR-Zykluszählung gewählt. Abbildung 4C zeigt ein Beispiel für eine qPCR aus einer typischen cDNA-Bibliothek, die eine maximale Zykluszahl von 16 ergab. Dieser Wert wurde dann für die abschließende χCRAC-PCR verwendet. Um die sequenzierten Daten zu verarbeiten, verwendeten wir eine zuvor in unserem Labor entwickelte Software (pyCRAC) und die entsprechende Pipeline zur Analyse der kinetischen CRAC-Daten (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Diese Open-Source-Softwarewerkzeuge ermöglichen das Demultiplexen und Trimmen der Daten, das Entfernen von PCR-Duplikaten, die Identifizierung statistisch signifikanter Peaks, das Einlesen von Clustern in zusammenhängende Sequenzen und die Identifizierung von Bindungsmotiven39. Weitere Informationen zur Funktionsweise dieser Tools finden Sie auf den jeweiligen Webseiten.
Wir haben auch mit der Entwicklung eines χCRAC-Protokolls für Säugetierzellen begonnen. Die Mehrzahl der Säugetierzelllinien wird als Monoschicht gezüchtet und die Schale in unserem Vernetzer mit dem UV-durchlässigen Beutel ist für Experimente mit adhärenten Zellen nicht geeignet. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Stufe entwickelt, bei der Benutzer 1–2 Petrischalen (150 mm Durchmesser und 25 mm Tiefe) mit adhärenten Zellen UV-bestrahlen können (Abbildung 3B). In einem ersten Test wurde die Effizienz des Vernetzers für Säugetierzellen durch Vernetzung und Einfangen von stabil markiertem GFP-RBM7 unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörpern und einer traditionellen CLIP-basierten Aufreinigung gemessen. Wie in Abbildung 5A gezeigt, war der Vernetzer in der Lage, Protein-RNA-Komplexe aus Säugetierzellen, die als Monoschicht gezüchtet wurden, unter Verwendung von 254 nm UV-Bestrahlung mit Wirkungsgraden zu gewinnen, die mit einem weit verbreiteten UV-Bestrahlungsgerät vergleichbar sind. Standard-Zellkulturkunststoffe, die normalerweise für UV-Vernetzungsexperimente verwendet werden, sind jedoch bis 254 nm UV undurchdringlich. Daher würden die Zellen in unserem Vernetzer nur von der oberen Bank der UV-Lampen bestrahlt. Um dies zu überwinden, haben wir eine UV-durchlässige Quarz-Petrischale für Zellwachstum und Vernetzung entwickelt. Die Verwendung der Quarzkulturen zeigte eine robuste Rückgewinnung von Protein-RNA-Komplexen mit nur 2 s UV-Bestrahlung (Abbildung 5B). In Kombination mit RBP-Capture-Methoden für Säugetierzellen wie der CLIP-Technologie sind diese kurzen Vernetzungszeiten mit Zeitverläufen möglich, um raumzeitliche RNA-Bindungsprofile von RBPs als Reaktion auf genotoxischen Stress oder schnelle Verarmung von Proteinfaktoren oder parallel zur Transkriptions- oder Zellzyklussynchronisation zu erhalten.
Abbildung 6 zeigt mehrere Beispiele für die Nrd1-Daten, die von der χCRAC-Pipeline verarbeitet werden. Diese Abbildung wurde unter Verwendung der von der Pipeline generierten Bedgraph-Dateien und des Python-GenomeBrowser-Pakets (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/) erstellt, das wir entworfen haben, um die Erstellung von Genombrowserbildern der Daten in Publikationsqualität zu vereinfachen. Die grauen Rechtecke stellen genomische Regionen dar, die nicht-kodierende RNAs exprimieren, wie z. B. das kryptische instabile Transkript (CUTs), stabile uncharakterisierte Transkripte (SUTs)40 und Xrn1-sensitive instabile Transkripte (XUTs)41. Die Daten in Abbildung 6 zeigen, dass Nrd1 an viele dieser nicht-kodierenden RNA-Transkripte bindet, was mit der Idee übereinstimmt, dass dieses Protein am Abbau dieser Klasse von Transkripten beteiligt ist42. Abbildung 6A zeigt eine ~15 kb große Region auf Chromosom IV. Hier kam es zu einem signifikanten Anstieg der Bindung von Nrd1 an Transkripte, die für die hochaffinen Glukosetransporter HXT6 und HXT7 kodieren, die beide während des Glukosemangels hochreguliert werden. Es ist wahrscheinlich, dass die Beendigung der Transkription durch den NNS-Komplex die Induktionskinetik dieser Gene während des Glukosemangels beeinflussen kann. Abbildung 6B zeigt ein Beispiel für die Quervernetzung von Nrd1 zum Imd3-Transkript, von dem bekannt ist, dass es durch Nab3reguliert wird 43. In diesem Fall zeigten die Daten eine signifikante Verringerung der Bindung bei Glukosemangel. Frühere Arbeiten zeigten eine verminderte Bindung von Nab3 an das Tye7-Transkript während des Glukosemangels44. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung deuten die χCRAC-Daten darauf hin, dass die Bindung von Nrd1 während des Glukosemangels abnahm und die Quervernetzung von Nrd1 zu Tye7 nach 8 Minuten Stress am niedrigsten war (Abbildung 4C). Es scheint jedoch, dass dieser Effekt nur vorübergehend war, denn nach 14 Minuten Glukosemangel ging die Nrd1-Bindung wieder auf das Ausgangsniveau zurück.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des χCRAC-Protokolls. Getaggte Sorten wurden bis zur gewünschten Dichte angebaut. RBP steht für ein RNA-bindendes Protein. Anschließend wurde eine Referenzprobe entnommen und mit 254 nm UV-Licht vernetzt. Die verbleibenden Zellen wurden durch Filtration geerntet und dann schnell in das stressauslösende Medium überführt. Für das hier beschriebene χCRAC-Experiment wurden 1, 2, 4, 8, 14 und 20 min nach der Verschiebung Proben entnommen und vernetzt (1). Das zu untersuchende RBP wurde dann mit einer hochstringenten zweistufigen Affinitätsreinigung gereinigt (2). Als nächstes wurden die eingefangenen vernetzten RNAs teilweise mit RNasen verdaut, am 5'-Ende radioaktiv markiert und mit Adaptern ligiert (3). Die 5'-Adapter enthielten eindeutige "In-Read"-Barcode-Sequenzen, so dass die einzelnen Proben nach der Sequenzierung bioinformatisch getrennt werden konnten. Die RBP-RNA-Komplexe wurden dann eluiert, gepoolt und zusammen ausgefällt (4), mittels SDS-PAGE aufgelöst und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht (5). Anschließend wurde ein einzelner Gelschnitt mit dem radioaktiven Signal direkt über dem Hauptband, der im Autoradiographiebild mit einem gestrichelten roten Kästchen dargestellt ist, aus dem Gel herausgeschnitten (5). Die Gelschnitte wurden mit der Protease K behandelt und die RNA anschließend extrahiert (6), in cDNAs umgewandelt und mittels PCR amplifiziert (7). Im PCR-Schritt wurden zusätzliche Barcodes (gelber Block, der durch das P7-Oligo eingeführt wurde) eingeführt, so dass viele Bibliotheken in einer einzigen Spur gemultiplext werden konnten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Vernetzung und Vakuumfiltration. (A) Der Vernetzer. Die Zellsuspension wird in einen Trichter gegossen, der sich oben rechts in der Maschine befindet (siehe auch Abbildung 3A für eine Nahaufnahme) und in einem UV-transparenten Beutel gehalten, der sich in der mittleren Schale befindet. Dieser Beutel wird von zwei Verschlüssen flankiert, die geschlossen bleiben, bis der Benutzer die Maschine anweist, den Bestrahlungsschritt zu starten. Die Zellen werden sowohl oben als auch unten von den Trays mit UV-Licht bestrahlt. Das Gerät wird mit 254- und 365-nm-UV-Lampen geliefert, wobei letztere für PAR-CLIP-Experimente geeignet sind. Die Maschine wird über ein Touchscreen-Panel oben rechts bedient, mit dem die UV-Dosierung oder die Belichtungszeit gesteuert werden können. (B) Nach der Vernetzung werden die Zellen von der linken Seite der Maschine entleert. Die Zellsuspensionen werden durch Vakuum zurückgewonnen und in einen Glaskolben entleert, wo sie anschließend zur Ernte in eine Vakuumfiltrationsvorrichtung gegossen werden können. (C) Vakuum-Filtrationsgeräte. Diese werden über einen Clip geöffnet und geschlossen und ein Filter dazwischen gesteckt. Vier Filtrationsgeräte wurden parallel für sehr kurze Zeitreihen eingesetzt, um keine Zeit durch Filterwechsel zu verlieren. (D) Nach der Filtration wurde der Medienüberstand zur anschließenden Entsorgung in Kolben entleert. Unterhalb der Vakuumfiltrationsgeräte wurden Ventile installiert, um das Vakuum im System aufrechtzuerhalten, wenn der Filter entfernt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Vernetzung von suspendierten vs. adhärenten Zellen. (A) Der Vernetzer mit der Vari-X-Linkerkammer für Suspensionszellen. Die Zellkultur wird in den Probeneinlass (Trichter) gegossen, der sich oben rechts im Tray befindet. (B) Tablett, das Petrischalen aus Kunststoff oder Quarz aufnehmen kann, um adhärente Zellen oder kleine Volumina von Suspensionszellen zu vernetzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Vorbereitung der Bibliothek. (A) Beispiel eines Autoradiogramms aus einem Nrd1-HTP χCRAC-Experiment. Das starke, konzentrierte Signal repräsentiert das Protein, das zu sehr kurzen RNAs vernetzt ist, während der obige Abstrich das Protein darstellt, das mit RNAs vernetzt ist, die für die Sequenzierung ausreichend lang sind. (B) Der Abstrich wurde wie in einem Autoradiogramm nach der Gelexzision gezeigt. (C) Eine repräsentative qPCR aus einer χCRAC cDNA-Bibliothek. In diesem Beispiel wurde die maximale Amplifikation der cDNA nach 16 Zyklen erreicht. Somit wurden 16 Zyklen für die finale Verstärkung verwendet. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung von drei technischen qPCR-Replikaten dar. (D) Beispiel für ein Phosphorbild aus einer cDNA-Bibliothek auf einem 6%igen FSME-Gel. (E) cDNA-Längen- und Qualitätsanalyse aus einer chipbasierten Kapillarelektrophorese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Hoch-RNase-Test-iCLIP-Experiment zum Testen der Vernetzung in Säugetierzellen. Gezeigt werden Autoradiogramme aus GFP-RBM7 iCLIP-Experimenten, die die Effizienz der RNP-Rückgewinnung über verschiedene Vernetzungsenergien hinweg testeten. Immunpräzipitationen wurden mit Anti-GFP-Antikörpern durchgeführt, die an magnetische Beads auf vernetzten Zellen gekoppelt waren, die GFP-RBM7 stabil exprimierten. Immunpräzipitate wurden mit hohen Konzentrationen von RNase I inkubiert, um assoziierte RNAs auf kurze, gleichmäßige Längen zu trimmen. RNPs wurden durch 32P-Markierung und SDS-PAGE sichtbar gemacht und wandern als definierte Bande, nahe der Migration des unvernetzten Proteins. Die Quantifizierung zeigt die Ergebnisse densitometrischer Analysen von radioaktiv markierten RBM7-RNA-Signalen, die auf das Anti-GFP-Western-Blot-Signal normalisiert wurden. (A) Vernetzungszeitverlauf des üblicherweise verwendeten UVP-Vernetzers im Vergleich zu unserem Vernetzer (Vari-X-Vernetzer; (B) Vernetzungszeitverlauf unseres Vernetzers auf Quarz- (links) und Kunststoffkulturwaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Beispielhafte Genom-Browser-Diagramme, die die Leistungsfähigkeit von χCRAC zeigen, die differentielle, zeitliche Bindung von Nrd1 an seine Ziele zu zeigen. Jedes Feld zeigt Diagramme für einzelne Genomregionen. Die Pfeile zeigen an, auf welchem Strang die Gene kodiert sind (linker Zeigepfeil = Minusstrang; rechter Zeigepfeil = Plus-Strang). Die Zeitpunkte (min) werden durch t0, t1, t2 usw. auf den y-Achsen jedes Teildiagramms angegeben. Römische Ziffern, die die Chromosomen und die Koordinaten angeben, werden angezeigt. (A) Bei Glukoseentzug bindet Nrd1 zwei hochaffine Glukosetransporter, HXT6 und HXT7, die beide in diesem Zustand hochreguliert sind. (B) Es wurde beobachtet, dass Nrd1 an Imd3, ein bereits validiertes Ziel von Nab344, bindet, wobei die Intensität nach Glukosemangel abnimmt. (C) Die Nrd1-Bindung von Tye7 weist eine dynamische und transiente Natur auf, die nach Glukosemangel nach 8 min Stress auf ein Minimum abnimmt. Nach 14 min kehrt die Bindung jedoch wieder auf das Basalniveau zurück. Die Lesevorgänge wurden auf "Lesevorgänge pro Million" (RPM; y-Achse) normalisiert. Graue Kästchen kennzeichnen Regionen, die nicht-kodierende RNAs kodieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Die kinetische Vernetzung und Analyse von cDNA ist eine Methode, die es ermöglicht, die Dynamik von Protein-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird das Protokoll detailliert beschrieben, einschließlich des Wachstums von Hefezellen, der UV-Vernetzung, der Ernte, der Proteinreinigung und der Vorbereitungsschritte der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek.

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K Aufrufe.  University of Edinburgh. Die kinetische Vernetzung und Analyse von cDNA ist eine Methode, die es ermöglicht, die Dynamik von Protein-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird das Protokoll detailliert beschrieben, einschließlich des Wachstums von Hefezellen, der UV-Vernetzung, der Ernte, der Proteinreinigung und der Vorbereitungsschritte der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek.

Serie: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) data. The protocol presented here describes in detail how to obtain a near-atomic resolution structure starting from cryo-EM micrograph movies by guiding users through all steps of the single particle structure determination pipeline. These steps are controlled from the new SPHIRE graphical user interface and require minimum user intervention. Using this protocol, a 3.5 &#197; structure of TcdA1, a Tc toxin complex from Photorhabdus luminescens, was derived from only 9500 single particles. This streamlined approach will help novice users without extensive processing experience and a priori structural information, to obtain noise-free and unbiased atomic models of their purified macromolecular complexes in their native state.

This paper presents a protocol for processing cryo-EM images using the software suite SPHIRE. The present protocol can be applied for nearly all single particle EM projects that target near-atomic resolution.

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.