Ce travail a été soutenu par des subventions du Wellcome Trust (091549 à S.G et 109093/Z/15/A à S.M.), de la subvention de base (092076) du Wellcome Trust Centre for Cell Biology et de la bourse de recherche senior non clinique du Conseil de recherches médicales (MR/R008205/1 à S.G.), de l’Organisation européenne de biologie moléculaire dans le cadre d’une bourse postdoctorale de longue durée (ALTF 1070-2017 à R.A.C), et le Fonds indépendant de recherche du Danemark (T.H.J).

A. Langford et W. Worboys sont affiliés à UVO3, une société commerciale. Ils n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’interprétation des données, ni dans la décision de soumettre le travail pour publication.

La méthode χCRAC, combinée aux nouveaux dispositifs de réticulation et de prélèvement cellulaire, présente un grand potentiel car elle est applicable à un large éventail d’organismes modèles et devrait donc présenter un intérêt général pour le domaine de l’ARN. Il existe de nombreux domaines dans lesquels χCRAC peut être utilisé. Par exemple, la méthode pourrait être utilisée pour mesurer l’assemblage hiérarchique des protéines en grands complexes macromoléculaires, tels que le splicéosome et le ribosome, ce qui implique souvent des interactions dynamiques entre les protéines et les molécules d’ARN. Nous l’utilisons aussi couramment pour surveiller les interactions entre les facteurs de désintégration de l’ARN et leurs substrats lorsque les cellules sont soumises à divers types de stress. Cela nous permet de déterminer à quel stade de la réponse adaptative ces facteurs sont les plus actifs, à quels substrats ils se lient et à quel point ces interactions sont dynamiques. Ces données devraient permettre aux chercheurs de déterminer la contribution relative de chaque facteur à l’adaptation aux changements environnementaux.
χCRAC utilise des marqueurs de purification à double affinité (HTF ou HTP) pour purifier la protéine dans des conditions très strictes et dénaturantes. Cela garantit que l’ARN copurifié est hautement enrichi pour les ARN qui ont été réticulés de manière covalente à la protéine d’intérêt. Cependant, s’appuyer sur des balises d’affinité présente des inconvénients. Par exemple, l’étiquette pourrait interférer avec la fonction de la protéine, ce qui pourrait donner une lecture déformée de son interactome de liaison à l’ARN. De plus, pour certains organismes modèles, il n’est pas toujours possible d’utiliser des marqueurs parce que les outils génétiques pour intégrer des fragments d’ADN dans le génome ou pour transformer des plasmides d’expression ne sont pas encore disponibles. Cependant, il est facile de modifier certaines parties du protocole χCRAC pour le rendre compatible avec les protocoles basés sur CLIP qui reposent sur des anticorps pour la purification du RBP. En effet, cette étude a montré qu’il est possible de combiner des purifications à base d’iCLIP avec notre réticulation. Nous sommes actuellement en train de développer des protocoles CLIP pour étudier l’association temporelle des protéines de liaison à l’ARN humain avec les transcrits d’ARN naissants.
Lors de l’exécution de χCRAC sur une nouvelle protéine, l’exposition aux UV doit être optimisée afin d’induire une réticulation maximale. Ceci est important car des expositions élevées aux UV peuvent réduire la récupération de l’ARN pendant l’étape de purification. Les cellules exprimant la RBP recombinante ont été exposées à diverses doses d’UV, 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 et 1 J/cm2. Les RNP ont ensuite été capturés et les ARN ont été fragmentés et radiomarqués. Ensuite, les RNP ont été résolus par SDS-PAGE et un autoradiogramme a été pris afin de déduire quelle exposition donnait le signal le plus intense (c’est-à-dire la réticulation maximale).
Une fois les conditions expérimentales optimisées, plusieurs expériences de contrôle sont recommandées lors de l’exécution de χCRAC. Tout d’abord, un échantillon non marqué irradié par UV peut être utilisé pour surveiller la liaison de fond aux billes de purification. Deuxièmement, lors de l’application de χCRAC au cours d’une expérience de décalage, une deuxième série chronologique où les cellules sont replacées dans le milieu d’origine permet de déterminer si la filtration des cellules elle-même induit des changements dans les niveaux d’ARN ou les interactions protéine-ARN.
Comme mentionné dans l’introduction, de nombreux articles récemment publiés suggèrent un certain nombre d’optimisations du protocole CLIP. Cela comprend l’utilisation d’adaptateurs marqués par fluorescence pour détecter le complexe protéine-ARN par balayage infrarouge10 ainsi que l’optimisation de diverses étapes de purification des acides nucléiques et de sélection de la taille qui augmentent la complexité des bibliothèques résultantes 12,45. Nous mettons actuellement en œuvre certaines de ces améliorations afin d’affiner le protocole χCRAC. Le protocole présenté ici contient déjà un certain nombre d’améliorations par rapport aux protocoles originaux CRAC et χCRAC qui augmentent la complexité des données. Par exemple, auparavant, après avoir résolu les complexes protéine-ARN radioactifs réticulés sur des gels SDS-PAGE, ils étaient transférés dans une membrane de nitrocellulose et l’ARN réticulé était isolé du transfert. Cependant, le transfert du RNP et l’extraction ultérieure de l’ARN peuvent être très inefficaces, en particulier lorsqu’il s’agit de grands RBP tels que les sous-unités d’ARN polymérase. Cela peut entraîner une réduction significative de la récupération de l’ARN réticulé. Dans le protocole actuel, l’ARN réticulé est extrait directement des tranches de gel SDS-PAGE comme illustré à la figure 1. Cela a augmenté la récupération des ARN réticulés. De plus, après amplification par PCR des ADNc, le produit a été initialement résolu sur des gels d’agarose à 3% à basse température de fusion, puis des produits PCR de 175 à 300 pb ont été extraits du gel. Cependant, ces gels peuvent être facilement surchargés, ce qui entraîne une très mauvaise séparation de l’ADN. Le remplacement des gels d’agarose par des gels TBE préfabriqués a permis une séparation plus uniforme de la taille et une meilleure récupération des produits de PCR.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

Les ARN s’appuient souvent sur les RBP pour exercer leur fonction, ce qui a suscité un grand intérêt pour la compréhension de la dynamique entre ces molécules. De nombreuses pratiques de récupération des bénéfices durables ont été identifiées dans une grande variété d’organismes. Cependant, il a toujours été notoirement difficile d’étudier les interactions RBP-ARN in vivo. Une percée majeure dans l’étude de ces interactions est venue avec l’émergence de CLIP1. Cette méthode utilise l’irradiation ultraviolette (UV, 254 nm) pour induire des liaisons covalentes entre les RBP et leurs ARN directement liés (c.-à-d. réticulation à distance nulle). Par la suite, la RBP d’intérêt est immunopurifiée dans des conditions rigoureuses pour s’assurer que seuls les ARN réticulés de manière covalente aux protéines sont identifiés. Les ARN liés sont ensuite partiellement digérés avec des RNases et ensuite convertis en banques d’ADNc pour le séquençage. La rigueur élevée de la purification est importante car elle augmente considérablement la spécificité de la récupération des protéines et de l’ARN, qui est également renforcée par la purification SDS-PAGE du complexe ribonucléoprotéine réticulée (RNP). CLIP et les méthodes connexes fournissent également un aperçu de la résolution nucléotidique dans le site de liaison à la protéine, car lors de la préparation de la bibliothèque de séquençage, les acides aminés qui ont réticulé l’ARN terminent fréquemment la transcriptase inverse ou provoquent l’introduction de mutations par l’enzyme sur ce site 1,2,3.
Depuis son introduction, le protocole CLIP original a produit une variété remarquable de méthodologies dérivées. Une percée particulièrement importante est venue avec le développement de HITS-CLIP (ou CLIP-seq), qui fusionne le séquençage à haut débit avec l’approche CLIP3. Cela a depuis été adopté par toutes les méthodologies basées sur CLIP. iCLIP a introduit des améliorations dans les techniques de rognage et de ligature de l’adaptateur médiées par RNase qui facilitent une cartographie plus précise des sites de liaison RBP4. PAR-CLIP a combiné le marquage 4thio-uridine/uracile avec la réticulation à 365 nm, ce qui a permis de cartographier les sites de réticulation en analysant les substitutions T-C5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP et uvCLAP ont introduit des conditions de dénaturation et des étapes de purification à double affinité qui réduisent davantage la liaison de fond à la résine d’affinité et augmentent encore la spécificité de la capture des protéines 2,6,7,8,9. De plus, CRAC, uvCLAP et dCLIP ont introduit le marquage de la RBP d’intérêt avec une étiquette d’affinité, éliminant ainsi la nécessité de générer des anticorps spécifiques.
Plusieurs optimisations ont également été apportées pour accélérer la méthodologie CLIP. Le protocole CLIP original utilisait le radiomarquage des ARN capturés afin de visualiser les complexes RBP-ARN après SDS-PAGE. Cependant, l’utilisation de la radioactivité peut être problématique pour les laboratoires qui ne sont pas mis en place pour de tels travaux. irCLIP intègre un adaptateur couplé aux fluorophores qui facilite la visualisation par imagerie infrarouge10 et sCLIP utilise la biotinylation des ARN capturés afin de les visualiser à travers HRP11 conjugué à la streptavidine. De plus, eCLIP renonce complètement au marquage de l’ARN; Au lieu de cela, la protéine est excisée uniquement en fonction de sa taille connue12. La purification à base de streptavidine a également été utilisée pour accélérer le processus de préparation de la bibliothèque dans FAST-iCLIP, où un adaptateur 3' biotinylé est ligaturé sur les ARN et utilisé pour permettre la purification après transcription inverse et circularisation13. Des améliorations supplémentaires apportées au protocole iCLIP ont également considérablement accru la complexité des bibliothèques4.
Enfin, CLIP a été modifié pour permettre la capture de RBP à partir de différents sous-compartiments cellulaires 14,15, pour visualiser les ARN nouvellement transcrits en utilisant l’induction pulsée de ribonucléosides photoactivables 5,16,17, pour capturer les ARN méthylés18,19,20, pour examiner les interactions ARN-ARN 21,22, et pour cartographier les extrémités 3' 23,24.
Malgré les grandes contributions des techniques basées sur CLIP pour nous aider à comprendre les interactions entre les RBP et les ARN, elles ont été limitées par l’inefficacité de la réticulation UV. Bien que les cellules de culture cultivées dans une monocouche soient généralement relativement faciles à réticuler, cela est beaucoup plus difficile dans les tissus ou les cellules en solution. Les tissus peuvent nécessiter plusieurs cycles d’exposition aux UV pour pénétrer dans les couches cellulaires requises, tandis que les cellules microbiennes sont souvent cultivées dans des milieux riches contenant des composés aromatiques absorbant les UV25. En effet, des temps d’irradiation UV allant jusqu’à 30 min ont été utilisés pour générer une réticulation suffisante entre les RBP et leurs ARN liés pour de tels échantillons26,27,28. Cette exposition prolongée aux UV induit des réponses au stress dans la cellule, telles que des dommages à l’ADN induits par les UV, qui peuvent contaminer les données finales dans certaines applications.
La majorité des études CLIP se sont concentrées sur la génération d'« instantanés » uniques d’interactions protéine-ARN spécifiques dans une cellule. Cependant, les interactions protéine-ARN sont intrinsèquement dynamiques, en particulier lorsque les cellules sont sujettes à des changements dans leur environnement. Cela peut inclure une réduction soudaine de la disponibilité des nutriments essentiels ou des changements rapides de température. Ainsi, pour vraiment comprendre le rôle d’une RBP en période de stress, il est préférable d’effectuer des analyses résolues dans le temps, car elles peuvent saisir tout le spectre des cibles RBP pendant le stress et déterminer à quel stade de la réponse au stress la RBP choisie est active. En particulier, des études sur la levure ont montré que les premières minutes d’adaptation sont absolument cruciales pour la survie et que les demi-vies de l’ARN chez les bactéries peuvent varier de quelques minutes à quelques secondes 29,30,31,32,33. Par conséquent, de telles analyses résolues dans le temps devraient idéalement être effectuées à une résolution temporelle élevée. Cependant, les longs temps de réticulation rendent l’étude des réponses adaptatives à un stade précoce particulièrement difficile.
Afin de surmonter ces problèmes, nous avons récemment développé une méthode améliorée capable de réticuler et de récolter des cellules sur des échelles de temps d’une minute. Notre méthode χCRAC permet une mesure quantitative des changements dynamiques dans les interactions RBP-ARN à une résolution inédite. Le développement d’un nouveau dispositif d’irradiation UV32 qui réduit le temps de réticulation requis dans les levures et les bactéries en solution environ 10 fois, congelant efficacement les interactions RBP-ARN instantanément, a joué un rôle crucial dans cette méthode. De plus, afin de récolter rapidement les cellules après irradiation UV, nous avons développé un dispositif de filtration sous vide capable de récolter des levures à croissance exponentielle dans une culture de 0,5 L en environ 30 s32. Ces innovations technologiques permettent l’étude de la dynamique RBP-ARN à une résolution à l’échelle infime. De plus, nous avons également introduit plusieurs optimisations au protocole originalCRAC 2 afin d’augmenter sa praticité.
En utilisant χCRAC, nous avons récemment étudié le cibleome d’une RBP nucléaire de levure, Nab3, en réponse à la privation de glucose. Chez Saccharomyces cerevisiae, Nab3 peut former un complexe avec Nrd1, un RBP et l’hélicase à ARN Sen1 pour former le complexe NNS. La liaison de NNS à l’ARN polymérase et au transcrit naissant peut déclencher la terminaison transcriptionnelle34. Ce complexe est principalement impliqué dans l’élimination des transcrits d’ARN cryptiques non codants, mais il a également été démontré qu’il régule l’expression des gènes codant pour les protéines. L’étude a montré un ciblage différentiel de Nab3 par rapport aux transcriptions non codantes et codantes après seulement une minute de stress32. Nous avons démontré que la terminaison co-transcriptionnelle par Nab3 entraîne une expression très transitoire, semblable à une impulsion, des gènes rétrotransposons, ce qui aurait été difficile à détecter en utilisant des approches traditionnelles basées sur CLIP. De plus, les temps d’irradiation UV courts dans notre réticulation UV ont également augmenté de manière significative la récupération des ARN non codants à vie courte32. χCRAC sera probablement un outil crucial pour élucider non seulement comment les pratiques commerciales restrictives façonnent la réponse au stress sur des échelles de temps immédiates, mais aussi leurs rôles changeants tout au long du cycle de vie d’une intervention. Ce manuscrit donne un aperçu détaillé de toutes les étapes du protocole χCRAC. À des fins d’illustration, la méthode a été utilisée pour étudier la protéine de levure Nrd1, qui est impliquée dans la terminaison transcriptionnelle et la désintégration de l’ARN35,36, et son cibleome ARN en réponse à la privation de glucose sur une multitude de points temporels. Enfin, nous démontrons également que notre unité d’irradiation UV peut rapidement réticuler les RBP à l’ARN dans les cellules HeLa, ce qui permet également d’effectuer des analyses à haute résolution résolues dans le temps dans les cellules adhérentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

L’interaction entre les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et leurs substrats d’ARN présente fluidité et complexité. Au cours de sa durée de vie, un seul ARN peut être lié par de nombreux RBP différents qui réguleront sa production, sa stabilité, son activité et sa dégradation. En tant que tel, beaucoup a été fait pour comprendre la dynamique qui existe entre ces deux types de molécules. Une percée particulièrement importante a été réalisée avec l’émergencede l’encrage et de larécipitation (CLIP). Cette technique a permis d’étudier rigoureusement quels ARN sont liés par une RBP particulière. En bref, la protéine d’intérêt est réticulée par UV à ses substrats d’ARN in vivo, purifiée dans des conditions très strictes, puis les ARN réticulés par covalence à la protéine sont convertis en banques d’ADNc et séquencés. Depuis sa conception, de nombreuses techniques dérivées ont été développées afin de rendre CLIP adapté à des domaines d’étude particuliers. Cependant, la réticulation à l’aide de la lumière ultraviolette est notoirement inefficace. Il en résulte des temps d’exposition prolongés qui rendent impossible l’étude temporelle des interactions RBP-ARN. Pour surmonter ce problème, nous avons récemment conçu et construit des dispositifs d’irradiation UV et de collecte de cellules bien améliorés. À l’aide de ces nouveaux outils, nous avons développé un protocole d’analyses à résolution temporelle des interactions RBP-ARN dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle : Kinetic CRoss-linking et Analysis of cDNA (χCRAC). Nous avons récemment utilisé cette technique pour étudier le rôle des RBP de levure dans l’adaptation au stress nutritif. Ce manuscrit donne un aperçu détaillé de la méthode χCRAC et présente les résultats récents obtenus avec le RBP Nrd1.

Pour démontrer l’efficacité de la méthode χCRAC, une expérience temporelle avec des souches de levure exprimant une protéine Nrd1 marquée au HTP a été réalisée. Une représentation schématique détaillée décrivant le fonctionnement de la méthode est fournie à la figure 1. Comme Nab3, Nrd1 est impliqué dans la désintégration de l’ARN nucléaire d’une variété de transcrits d’ARN37. Des travaux antérieurs du laboratoire Corden ont suggéré que la liaison de Nrd1 à ses cibles d’ARN change de manière significative lorsque les cellules sont soumises à une privation de glucose28,38. En tant que tels, les cellules se développant exponentiellement dans un milieu contenant du glucose (SD-TRP) ont été déplacées vers le même milieu sans glucose (S-TRP) au cours d’une période de temps pour surveiller les changements dynamiques dans les interactions Nrd1-ARN. Des échantillons ont été prélevés et réticulés dans la chambre de liaison Vari-X (figure 3A) avant le poste, puis après 1, 2, 4, 8, 14 et 20 minutes. Le milieu utilisé pour la croissance cellulaire était délibérément déficient en tryptophane pour réduire l’absorption UV par cet acide aminé aromatique. Notez qu’il est préférable d’utiliser un milieu synthétique stérilisé par filtre car l’autoclavage du milieu peut entraîner une caramélisation des sucres. Cela réduit ensuite l’efficacité de la réticulation.
La figure 4A montre une autoradiographie représentative d’une expérience χCRAC. Notez que dans cet exemple, les échantillons n’ont pas été regroupés. Au lieu de cela, chacun a été exécuté individuellement sur le gel. Ceci est recommandé pour les tests expérimentaux initiaux afin de montrer que la protéine se lie efficacement à l’ARN à tous les points temporels testés. Un signal particulièrement intense a été observé au poids moléculaire attendu de la RBP, représentant la protéine liée à des ARN radiomarqués très courts et ne se prêtant pas au séquençage. Par conséquent, le signal de frottis au-dessus de cette bande, qui est la protéine réticulée à des fragments d’ARN plus longs, a été isolé. Le fragment a été coupé juste au-dessus de la bande protéique plus environ 30 kDa. La figure 4B montre un autoradiogramme après l’excision, avec la protéine réticulée aux ARN courts laissés dans le gel et le signal précédemment frottis maintenant excisé.
Après transcription inverse, la bibliothèque d’ADNc doit être amplifiée par PCR. Cependant, la suramplification de la bibliothèque doit être évitée car cela peut introduire un biais vers des séquences amplifiées préférentiellement par la polymérase et générer des artefacts de PCR. Les bibliothèques suramplifiées contiennent également un grand nombre de séquences dupliquées qui gaspillent les lectures sur le séquenceur. Afin de calculer le nombre idéal de cycles de PCR pour l’amplification de la bibliothèque finale, une partie aliquote de l’ADNc a été amplifiée par qPCR en utilisant les oligonucléotides P5 et BC. Le premier cycle auquel la bibliothèque a atteint le pic de fluorescence a été choisi comme nombre de cycles de PCR. La figure 4C donne un exemple de qPCR à partir d’une bibliothèque d’ADNc typique, qui a donné un nombre de cycles de pointe de 16. Cette valeur a ensuite été utilisée pour la PCR finale χCRAC. Afin de traiter les données séquencées, nous avons utilisé un logiciel précédemment développé dans notre laboratoire (pyCRAC) et le pipeline correspondant pour l’analyse des données CRAC cinétiques (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Ces outils logiciels open source permettent le démultiplexage et le découpage des données, la suppression des doublons de PCR, l’identification de pics statistiquement significatifs, la lecture de clusters en séquences contiguës et l’identification de motifs de liaison39. De plus amples détails sur le fonctionnement de ces outils se trouvent sur leurs pages Web respectives.
Nous avons également commencé à développer un protocole χCRAC pour les cellules de mammifères. La majorité des lignées cellulaires de mammifères sont cultivées comme monocouche et le plateau de notre réticulateur avec le sac perméable aux UV ne convient pas aux expériences avec des cellules adhérentes. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une étape où les utilisateurs peuvent irradier UV 1 à 2 boîtes de Petri (150 mm de diamètre et 25 mm de profondeur) avec des cellules adhérentes (Figure 3B). Comme premier test, l’efficacité de la réticulation pour les cellules de mammifères a été mesurée par réticulation et capture de GFP-RBM7 marqués de manière stable à l’aide d’anticorps anti-GFP et d’une purification traditionnelle à base de CLIP. Comme le montre la figure 5A, l’agent de réticulation a pu récupérer des complexes protéine-ARN à partir de cellules de mammifères cultivées en monocouche en utilisant une irradiation UV de 254 nm avec des efficacités comparables à celles d’un dispositif d’irradiation UV largement utilisé. Cependant, les articles en plastique de culture cellulaire standard normalement utilisés pour les expériences de réticulation UV sont impénétrables aux UV de 254 nm. Par conséquent, dans notre réticulation, les cellules ne recevraient l’irradiation que de la banque supérieure de lampes UV. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une boîte de Petri en quartz perméable aux UV pour la croissance cellulaire et la réticulation. L’utilisation de la culture de quartz a montré une récupération robuste des complexes protéine-ARN avec aussi peu que 2 s d’irradiation UV (Figure 5B). Lorsqu’ils sont combinés à des méthodes de capture de RBP pour les cellules de mammifères telles que les technologies CLIP, ces temps de réticulation courts se prêtent à des parcours temporels pour récupérer les profils spatio-temporels de liaison à l’ARN des RBP en réponse à des stress génotoxiques ou à des déplétions rapides de facteurs protéiques, ou parallèlement à la synchronisation transcriptionnelle ou du cycle cellulaire.
La figure 6 montre plusieurs exemples de données Nrd1 traitées par le pipeline χCRAC. Cette figure a été préparée à l’aide des fichiers bedgraph générés par le pipeline et le paquet python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), que nous avons conçu pour simplifier la création d’images de navigateur génomique de qualité publication des données. Les rectangles gris représentent les régions génomiques qui expriment des ARN non codants, comme le transcrit instable cryptique (CUT), les transcrits stables non caractérisés (TUS)40 et les transcrits instables sensibles à Xrn1 (XUT)41. Les données de la figure 6 montrent que Nrd1 se lie à plusieurs de ces transcrits d’ARN non codants, ce qui est cohérent avec l’idée que cette protéine est impliquée dans la dégradation de cette classe de transcrits42. La figure 6A montre une région de ~15 kb sur le chromosome IV. Ici, il y a eu une augmentation significative de la liaison de Nrd1 aux transcrits codant pour les transporteurs de glucose de haute affinité HXT6 et HXT7, qui sont tous deux régulés à la hausse pendant la privation de glucose. Il est probable que la terminaison de transcription par le complexe NNS puisse influencer la cinétique d’induction de ces gènes pendant la privation de glucose. La figure 6B montre un exemple de réticulation Nrd1 avec le transcrit Imd3, qui est connu pour être régulé par Nab343. Dans ce cas, les données ont démontré une réduction significative de la liaison lors de la privation de glucose. Des travaux antérieurs ont montré une diminution de la liaison de Nab3 au transcrit Tye7 pendant la privation de glucose44. Conformément à cette observation, les données de χCRAC suggèrent que la liaison de Nrd1 a diminué pendant la privation de glucose et que la réticulation de Nrd1 avec Tye7 était à son plus bas après 8 minutes de stress (Figure 4C). Cependant, il semble que cet effet n’ait été que transitoire, car après 14 minutes de privation de glucose, la liaison Nrd1 est revenue aux niveaux de départ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Graphique 1 : Représentation schématique du protocole χCRAC. Les souches marquées ont été cultivées jusqu’à la densité souhaitée. RBP indique une protéine de liaison à l’ARN. Ensuite, un échantillon de référence a été prélevé et réticulé avec une lumière UV de 254 nm. Les cellules restantes ont été récoltées par filtration, puis rapidement déplacées vers le milieu induisant le stress. Pour l’expérience χCRAC décrite ici, des échantillons ont été prélevés et réticulés 1, 2, 4, 8, 14 et 20 minutes après le poste (1). La RBP d’intérêt a ensuite été purifiée à l’aide d’une purification d’affinité en deux étapes très stricte (2). Ensuite, les ARN réticulés capturés ont été partiellement digérés avec des RNases, radiomarqués à l’extrémité 5' et des adaptateurs ont été ligaturés sur eux (3). Les adaptateurs 5' contenaient des séquences de codes-barres uniques « en lecture » afin que les échantillons individuels puissent être séparés bio-informatique après le séquençage. Les complexes RBP-ARN ont ensuite été élués, regroupés et précipités ensemble (4), résolus par SDS-PAGE et visualisés par autoradiographie (5). Par la suite, une seule tranche de gel contenant le signal radioactif juste au-dessus de la bande principale, illustrée par une boîte rouge en pointillés dans l’image d’autoradiographie, a été découpée du gel (5). Les tranches de gel ont été traitées avec de la protéase K et l’ARN a ensuite été extrait (6), converti en ADNc et amplifié par PCR (7). L’étape PCR a introduit des codes-barres supplémentaires (bloc jaune introduit par P7 oligo) afin que de nombreuses bibliothèques puissent être multiplexées en une seule voie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figure 2 : Réticulation et filtration sous vide. (A) Le réticuleur. La suspension cellulaire est versée dans un entonnoir situé en haut à droite de la machine (voir également la figure 3A pour un gros plan) et maintenue dans un sac transparent aux UV situé dans le plateau du milieu. Ce sac est flanqué de deux volets qui restent fermés jusqu’à ce que l’utilisateur demande à la machine de démarrer l’étape d’irradiation. Les cellules sont irradiées avec la lumière UV des plateaux à la fois au-dessus et au-dessous. La machine est livrée avec des lampes UV de 254 et 365 nm, ces dernières étant applicables aux expériences PAR-CLIP. La machine est commandée par un écran tactile situé en haut à droite, ce qui permet de contrôler le dosage UV ou le temps d’exposition. (B) Après réticulation, les cellules sont drainées du côté gauche de la machine. Les suspensions cellulaires sont récupérées sous vide et drainées dans un flacon en verre où elles peuvent ensuite être versées dans un dispositif de filtration sous vide pour la récolte. C) Dispositifs de filtration sous vide. Ceux-ci sont ouverts et fermés via un clip et un filtre est inséré entre eux. Quatre dispositifs de filtration ont été utilisés en parallèle pour de très courtes séries chronologiques afin de ne pas perdre de temps à la suite du changement de filtre. (D) Après filtration, le surnageant du milieu a été égoutté dans des flacons en vue de leur élimination ultérieure. Des vannes ont été installées sous les dispositifs de filtration sous vide pour maintenir le vide dans le système lorsque le filtre est retiré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figure 3 : Réticulation des cellules suspendues par rapport aux cellules adhérentes. (A) La réticulation avec la chambre de liaison Vari-X pour les cellules en suspension. La culture cellulaire est versée dans l’entrée de l’échantillon (entonnoir) située en haut à droite du plateau. (B) Plateau pouvant contenir des boîtes de Petri en plastique ou en quartz pour la réticulation des cellules adhérentes ou de petits volumes de cellules en suspension. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figure 4 : Préparation de la bibliothèque. (A) Exemple d’autoradiogramme issu d’une expérience Nrd1-HTP χCRAC. Le signal fort et concentré représente la protéine réticulée aux ARN très courts, tandis que le frottis ci-dessus représente la protéine réticulée aux ARN de longueur suffisante pour le séquençage. (B) Le frottis a été excisé comme le montre un autoradiogramme prélevé après l’excision sur gel. (C) Une qPCR représentative d’une bibliothèque d’ADNc χCRAC. Dans cet exemple, l’amplification maximale de l’ADNc a été atteinte à 16 cycles. Ainsi, 16 cycles ont été utilisés pour l’amplification finale. La barre d’erreur représente l’écart-type de trois répétitions techniques qPCR. (D) Exemple d’une image phosphorée provenant d’une bibliothèque d’ADNc sur un gel de TBE à 6%. (E) Analyse de la longueur et de la qualité de l’ADNc à partir d’une électrophorèse capillaire à base de puce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figure 5 : Expérience iCLIP de test de RNase élevée pour tester la réticulation dans des cellules de mammifères. Les autoradiogrammes des expériences GFP-RBM7 iCLIP qui ont testé l’efficacité de la récupération RNP à travers diverses énergies de réticulation sont montrés. Les immunoprécipitations ont été réalisées à l’aide d’anticorps anti-GFP couplés à des billes magnétiques sur des cellules réticulées qui exprimaient de manière stable la GFP-RBM7. Les immunoprécipités ont été incubés avec des concentrations élevées de RNase I afin de réduire les ARN associés à des longueurs courtes et uniformes. Les RNP ont été visualisés par marquage 32P et SDS-PAGE et migrent comme une bande définie, proche de la migration de la protéine non réticulée. La quantification indique les résultats des analyses densitométriques du signal d’ARN RBM7 radiomarqué normalisé au signal Western blot anti-GFP. (A) Réticulation temporelle de la réticulation UVP couramment utilisée par rapport à notre réticulation (Vari-X-linker; VxL). (B) Réticulation temporelle de notre agent de réticulation sur des articles de culture en quartz (à gauche) et en plastique (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figure 6 : Exemples de graphiques de navigateur génomique montrant la puissance de χCRAC pour montrer la liaison différentielle et temporelle de Nrd1 à ses cibles. Chaque boîte montre des graphiques pour les régions génomiques individuelles. Les flèches indiquent sur quel brin les gènes sont codés (flèche pointant vers la gauche = brin moins; flèche pointante droite = brin plus). Les points temporels (min) sont indiqués par t0, t1, t2, etc. sur les axes y de chaque sous-placette. Les chiffres romains indiquant les chromosomes et les coordonnées sont affichés. (A) Lors de la privation de glucose, Nrd1 lie deux transporteurs de glucose de haute affinité, HXT6 et HXT7, qui sont tous deux régulés à la hausse dans cette condition. (B) On observe que Nrd1 se lie à Imd3, une cible déjà validée de Nab344, avec une intensité réduite après une privation de glucose. (C) La liaison Nrd1 de Tye7 présente une nature dynamique et transitoire, diminuant après une privation de glucose à un minimum après 8 minutes de stress. Cependant, la liaison revient ensuite aux niveaux basaux après 14 min. Les lectures ont été normalisées en « lectures par million » (RPM; axe y). Les cases grises indiquent les régions codant pour des ARN non codants. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

La réticulation cinétique et l’analyse de l’ADNc est une méthode qui permet d’étudier la dynamique des interactions protéine-ARN dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle. Ici, le protocole est décrit en détail, y compris la croissance des cellules de levure, la réticulation UV, la récolte, la purification des protéines et les étapes de préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération.

Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K vues.  University of Edinburgh. La réticulation cinétique et l’analyse de l’ADNc est une méthode qui permet d’étudier la dynamique des interactions protéine-ARN dans les cellules vivantes à haute résolution temporelle. Ici, le protocole est décrit en détail, y compris la croissance des cellules de levure, la réticulation UV, la récolte, la purification des protéines et les étapes de préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération.

Vidéo: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using χCRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) data. The protocol presented here describes in detail how to obtain a near-atomic resolution structure starting from cryo-EM micrograph movies by guiding users through all steps of the single particle structure determination pipeline. These steps are controlled from the new SPHIRE graphical user interface and require minimum user intervention. Using this protocol, a 3.5 &#197; structure of TcdA1, a Tc toxin complex from Photorhabdus luminescens, was derived from only 9500 single particles. This streamlined approach will help novice users without extensive processing experience and a priori structural information, to obtain noise-free and unbiased atomic models of their purified macromolecular complexes in their native state.

This paper presents a protocol for processing cryo-EM images using the software suite SPHIRE. The present protocol can be applied for nearly all single particle EM projects that target near-atomic resolution.

Analyse de particules à haute résolution à partir de microscopie à électrons à l&#39;aide d&#39;images utilisant SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Recherche

Biochimie

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore pour étudier l’interaction protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Surveillance de la cinétique d’agrégation des protéines in vivo à l’aide du comptage automatisé de l’inclusion chez Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

Collecte de routine d’ensembles de données cryo-EM haute résolution à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.