Este trabalho foi apoiado por subsídios do Wellcome Trust (091549 para S.G e 109093/Z/15/A para S.M.), o Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) e Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 para S.G.), a Organização Europeia de Biologia Molecular sob uma bolsa de pós-doutorado de longo prazo (ALTF 1070-2017 para R.A.C), e o Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

A. Langford e W. Worboys são afiliados à UVO3, uma empresa comercial. Eles não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e interpretação dos dados ou na decisão de submeter o trabalho para publicação.

O método χCRAC, combinado com os novos dispositivos de reticulação e colheita celular, tem grande potencial porque é aplicável a uma ampla gama de organismos modelo e, portanto, deve ser de interesse geral para o campo do RNA. Existem muitas áreas em que o χCRAC pode ser utilizado. Por exemplo, o método poderia ser usado para medir a montagem hierárquica de proteínas em grandes complexos macromoleculares, como o spliceossomo e o ribossomo, que muitas vezes envolve interações dinâmicas entre proteínas e moléculas de RNA. Nós também agora o usamos rotineiramente para monitorar interações entre fatores de decaimento de RNA e seus substratos quando as células são submetidas a diversos tipos de estresse. Isso nos permite determinar em que estágio da resposta adaptativa esses fatores são mais ativos, a que substratos eles se ligam e quão dinâmicas são essas interações. Tais dados devem permitir aos pesquisadores determinar a contribuição relativa de cada fator na adaptação às mudanças ambientais.
χCRAC usa etiquetas de purificação de dupla afinidade (HTF ou HTP) para purificar a proteína sob condições altamente rigorosas e desnaturantes. Isso garante que o RNA copurificado seja altamente enriquecido para RNAs que foram covalentemente reticulados com a proteína de interesse. No entanto, confiar em tags de afinidade tem desvantagens. Por exemplo, a etiqueta poderia interferir com a função da proteína, o que poderia dar uma leitura distorcida de seu interactome de ligação ao RNA. Além disso, para alguns organismos modelo nem sempre é possível utilizar tags porque as ferramentas genéticas para integrar fragmentos de DNA no genoma ou para transformar plasmídeos de expressão ainda não estão disponíveis. No entanto, é simples alterar algumas partes do protocolo χCRAC para torná-lo compatível com protocolos baseados em CLIP que dependem de anticorpos para purificação da RBP. De fato, este estudo mostrou que é possível combinar purificações baseadas em iCLIP com nosso reticulador. Estamos agora no processo de desenvolvimento de protocolos CLIP para estudar a associação temporal de proteínas ligadoras de RNA humano com transcritos de RNA nascente.
Ao realizar χCRAC em uma nova proteína, a exposição UV deve ser otimizada para induzir o máximo de ligações cruzadas. Isso é importante porque altas exposições UV podem reduzir a recuperação de RNA durante a etapa de purificação. As células que expressam RBP recombinante foram expostas a várias doses de UV, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 e 1 J/cm 2. As RNPs foram então capturadas e os RNAs foram fragmentados e radiomarcados. Em seguida, as RNPs foram resolvidas por SDS-PAGE e um auto-radiograma foi realizado para deduzir qual exposição deu o sinal mais intenso (ou seja, o cross-linking máximo).
Uma vez otimizadas as condições experimentais, vários experimentos de controle são recomendados na realização do χCRAC. Primeiro, uma amostra não marcada irradiada por UV pode ser usada para monitorar a ligação de fundo às esferas de purificação. Em segundo lugar, ao aplicar χCRAC durante um experimento de turno, uma segunda série temporal onde as células são deslocadas de volta para o meio original permite investigar se a filtração das próprias células induz mudanças nos níveis de RNA ou interações proteína-RNA.
Como mencionado na Introdução, numerosos artigos publicados recentemente sugerem uma série de otimizações para o protocolo CLIP. Isso inclui o uso de adaptadores fluorescentes marcados para detectar o complexo proteína-RNA por meio de varredura infravermelha10, bem como otimizações para várias etapas de purificação de ácido nucleico e seleção de tamanho que mostraram aumentar a complexidade das bibliotecas resultantes12,45. Atualmente, estamos implementando algumas dessas melhorias para refinar ainda mais o protocolo χCRAC. O protocolo aqui apresentado já contém uma série de melhorias em relação aos protocolos CRAC e χCRAC originais que aumentam a complexidade dos dados. Por exemplo, anteriormente, depois de resolver os complexos de proteína-RNA radioativo reticulados em géis SDS-PAGE, eles foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose e o RNA reticulado foi isolado do blot. No entanto, a transferência do RNP e a subsequente extração do RNA podem ser muito ineficientes, particularmente quando se trata de grandes RBPs, como as subunidades da RNA polimerase. Isso pode resultar em uma redução significativa na recuperação do RNA reticulado. No protocolo atual, o RNA reticulado é extraído diretamente de cortes de gel SDS-PAGE, conforme ilustrado na Figura 1. Isso aumentou a recuperação de RNAs reticulados. Além disso, após a amplificação por PCR dos cDNAs, o produto foi originalmente resolvido em géis de agarose de baixa temperatura de fusão a 3% e, em seguida, produtos de PCR de 175–300 pb foram extraídos do gel. No entanto, esses géis podem ser facilmente sobrecarregados, resultando em uma separação muito pobre do DNA. A substituição de géis de agarose por géis TBE pré-moldados resultou em separação de tamanho mais consistente e melhor recuperação dos produtos de PCR.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

Os RNAs frequentemente dependem de RBPs para exercer sua função, o que tem levado a um grande interesse em entender a dinâmica entre essas moléculas. Muitas RBPs têm sido identificadas em uma grande variedade de organismos. No entanto, sempre foi notoriamente difícil estudar interações RBP-RNA in vivo. Um grande avanço no estudo de tais interações veio com o surgimento do CLIP1. Este método utiliza irradiação ultravioleta (UV, 254 nm) para induzir ligações covalentes entre RBPs e seus RNAs diretamente ligados (i.e., reticulação de distância zero). Posteriormente, a RBP de interesse é imunopurificada sob condições rigorosas para garantir que apenas RNAs covalentemente ligados às proteínas sejam identificados. Os RNAs ligados são então parcialmente digeridos com RNases e posteriormente convertidos em bibliotecas de cDNA para sequenciamento. A alta erudência de purificação é importante, pois aumenta muito a especificidade da recuperação de proteínas e RNA, que também é reforçada através da purificação SDS-PAGE do complexo ribonucleoproteína reticulada (RNP). O CLIP e métodos relacionados também fornecem informações sobre a resolução de nucleotídeos no sítio de ligação às proteínas, pois durante a preparação da biblioteca de sequenciamento, aminoácidos que se reticulam com o RNA frequentemente terminam a transcriptase reversa ou fazem com que a enzima introduza mutações nesse local 1,2,3.
Desde sua introdução, o protocolo CLIP original produziu uma notável variedade de metodologias derivadas. Um avanço particularmente importante veio com o desenvolvimento do HITS-CLIP (ou CLIP-seq), que mescla o sequenciamento de alto rendimento com a abordagem CLIP3. Isso já foi adotado por todas as metodologias baseadas em CLIP. O iCLIP introduziu melhorias nas técnicas de corte mediado por RNase e ligadura adaptadora que facilitam o mapeamento mais preciso dos sítios de ligação da RBP4. PAR-CLIP combinou marcação 4tio-uridina/uracila com reticulação a 365 nm, tornando possível mapear sítios de reticulação analisando substituições T-C5. CRAC, ureia-iCLIP, dCLIP e uvCLAP introduziram condições de desnaturação e etapas de purificação de dupla afinidade que reduzem ainda mais a ligação de fundo à resina de afinidade e aumentam ainda mais a especificidade da captura de proteínas 2,6,7,8,9. Além disso, CRAC, uvCLAP e dCLIP introduziram a marcação da RBP de interesse com uma etiqueta de afinidade, superando assim a necessidade de gerar anticorpos específicos.
Várias otimizações também foram feitas para agilizar a metodologia CLIP. O protocolo CLIP original utilizava radiomarcação dos RNAs capturados para visualizar os complexos RBP-RNA após SDS-PAGE. No entanto, o uso de radioatividade pode ser problemático para laboratórios não configurados para esse tipo de trabalho. O irCLIP incorpora um adaptador acoplado a fluoróforo que facilita a visualização através de imagens infravermelhas10 e o sCLIP utiliza a biotinilação de RNAs capturados para visualizá-los através da HRP conjugada com estreptavidina11. Além disso, o eCLIP renuncia completamente à marcação de RNA; em vez disso, a proteína é excisada com base apenas em seu tamanho conhecido12. A purificação à base de estreptavidina também tem sido usada para acelerar o processo de preparação da biblioteca no FAST-iCLIP, onde um adaptador biotinilado de 3' é ligado aos RNAs e usado para permitir a purificação após transcrição reversa e circularização13. Aprimoramentos adicionais no protocolo iCLIP também aumentaram consideravelmente a complexidade das bibliotecas4.
Finalmente, o CLIP foi modificado para permitir a captura de RBPs de diferentes subcompartimentos celulares 14,15, para visualizar RNAs recém-transcritos usando indução pulsada de ribonucleosídeos fotoativáveis 5,16,17, para capturar RNAs metilados18,19,20, para examinar interações RNA-RNA 21,22 e para mapear as extremidades 3' 23,24.
Apesar das grandes contribuições das técnicas baseadas em CLIP para auxiliar nossa compreensão das interações entre RBPs e RNAs, ela tem sido limitada pela ineficiência da reticulação UV. Embora as células de cultura cultivadas em uma monocamada sejam geralmente relativamente fáceis de fazer ligações cruzadas, isso é significativamente mais desafiador em tecidos ou células em solução. Os tecidos podem requerer várias rodadas de exposição UV para penetrar nas camadas celulares necessárias, enquanto as células microbianas são frequentemente cultivadas em meios ricos que contêm compostos aromáticos que absorvem UV25. De fato, tempos de irradiação UV de até 30 min têm sido usados para gerar ligações cruzadas suficientes entre RBPs e seus RNAs ligados para tais amostras26,27,28. Essa exposição prolongada aos raios UV induz respostas de estresse dentro da célula, tais danos ao DNA induzidos por UV, que podem contaminar os dados finais em algumas aplicações.
A maioria dos estudos CLIP tem se concentrado em gerar "instantâneos" únicos de interações específicas proteína-RNA em uma célula. No entanto, as interações proteína-RNA são inerentemente dinâmicas, particularmente quando as células estão sujeitas a mudanças em seu ambiente. Isso pode incluir uma redução repentina na disponibilidade de nutrientes essenciais ou mudanças rápidas na temperatura. Como tal, para realmente entender o papel de uma RBP durante o estresse, é melhor realizar análises resolvidas no tempo, porque elas podem capturar todo o espectro de alvos de RBP durante o estresse e determinar em que estágio da resposta ao estresse a RBP escolhida está ativa. Em particular, estudos em leveduras mostraram que os primeiros minutos de adaptação são absolutamente cruciais para a sobrevivência e meias-vidas de RNA em bactérias podem variar de minutos a segundos 29,30,31,32,33. Portanto, essas análises resolvidas no tempo idealmente devem ser realizadas em alta resolução temporal. No entanto, os longos tempos de ligações cruzadas tornam o estudo de respostas adaptativas em estágio inicial particularmente desafiador.
A fim de superar esses problemas, desenvolvemos recentemente um método aprimorado que é capaz de reticular e coletar células em escalas de tempo de minutos longos. Nosso método χCRAC permite a medição quantitativa de mudanças dinâmicas nas interações RBP-RNA em resolução não testemunhada anteriormente. Crucial para este método foi o desenvolvimento de um novo dispositivo de irradiação UV32 que reduz o tempo necessário de reticulação em leveduras e bactérias em solução em cerca de 10 vezes, congelando efetivamente as interações RBP-RNA instantaneamente. Além disso, a fim de colher rapidamente as células após a irradiação UV, desenvolvemos um dispositivo de filtração a vácuo que pode colher leveduras de crescimento exponencial em uma cultura de 0,5 L em cerca de 30 s32. Essas inovações tecnológicas permitem o estudo da dinâmica do RNA-RBP em resolução em escala minúscula. Além disso, também introduzimos várias otimizações ao protocolo CRAC2 original, a fim de aumentar sua praticidade.
Usando χCRAC, recentemente estudamos o targetoma de uma RBP nuclear de levedura, Nab3, em resposta à privação de glicose. Em Saccharomyces cerevisiae, Nab3 pode formar um complexo com Nrd1, um RBP, e o RNA helicase Sen1 para formar o complexo NNS. A ligação do NNS à RNA polimerase e ao transcrito nascente pode desencadear a terminação transcricional34. Este complexo está principalmente envolvido na remoção de transcritos de RNA não codificantes crípticos, mas também foi mostrado para regular a expressão de genes codificadores de proteínas. O estudo mostrou direcionamento diferencial de Nab3 para transcritos não codificantes e codificantes após apenas um minuto de estresse32. Demonstramos que a terminação cotranscricional por Nab3 resulta em uma expressão muito transitória, semelhante a pulso, de genes retrotransposons, o que teria sido difícil de detectar usando abordagens tradicionais baseadas em CLIP. Além disso, os curtos tempos de irradiação UV em nosso reticulador UV também aumentaram significativamente a recuperação de RNAs não codificantes de curta duração32. χCRAC provavelmente será uma ferramenta crucial para elucidar não apenas como as RBPs moldam a resposta ao estresse em escalas de tempo imediatas, mas também suas mudanças de papéis durante todo o ciclo de vida de uma resposta. Este manuscrito fornece uma visão detalhada de todas as etapas do protocolo χCRAC. Para fins ilustrativos, o método foi usado para estudar a proteína Nrd1 da levedura, que está envolvida na terminação transcricional e decaimento do RNA35,36, e seu alvo de RNA em resposta à privação de glicose em uma infinidade de pontos de tempo. Finalmente, também demonstramos que nossa unidade de irradiação UV pode rapidamente fazer ligações cruzadas de RBPs ao RNA em células HeLa, tornando possível também realizar análises de alta resolução resolvidas no tempo em células aderentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

A interação entre proteínas ligadoras de RNA (RBPs) e seus substratos de RNA exibe fluidez e complexidade. Dentro de sua vida útil, um único RNA pode ser ligado por muitas RBPs diferentes que irão regular sua produção, estabilidade, atividade e degradação. Como tal, muito tem sido feito para compreender a dinâmica que existe entre estes dois tipos de moléculas. Um avanço particularmente importante veio com o surgimento da "cross-l inking and immunoprecipitation" (CLIP). Essa técnica permitiu uma investigação rigorosa sobre quais RNAs estão ligados por uma RBP em particular. Em suma, a proteína de interesse é reticulada UV com seus substratos de RNA in vivo, purificada sob condições altamente rigorosas, e então os RNAs covalentemente reticulados à proteína são convertidos em bibliotecas de cDNA e sequenciados. Desde a sua concepção, muitas técnicas derivadas foram desenvolvidas a fim de tornar o CLIP passível de campos de estudo particulares. No entanto, ligações cruzadas usando luz ultravioleta são notoriamente ineficientes. Isso resulta em tempos de exposição prolongados que impossibilitam o estudo temporal das interações RBP-RNA. Para superar esse problema, recentemente projetamos e construímos dispositivos de irradiação UV e colheita de células muito aprimorados. Usando essas novas ferramentas, desenvolvemos um protocolo para análises resolvidas no tempo de interações RBP-RNA em células vivas em alta resolução temporal: Cinética CRoss-linking e Analysis of cDNAs (χCRAC). Recentemente, utilizamos esta técnica para estudar o papel das RBPs de levedura na adaptação ao estresse por nutrientes. Este manuscrito fornece uma visão detalhada do método χCRAC e apresenta resultados recentes obtidos com a RBP Nrd1.

Para demonstrar a eficácia do método χCRAC, um experimento de curso de tempo com cepas de levedura expressando uma proteína Nrd1 marcada com HTP foi realizado. Uma representação esquemática detalhada descrevendo como o método funciona é fornecida na Figura 1. Assim como Nab3, Nrd1 está envolvido no decaimento do RNA nuclear de uma variedade de transcritos de RNA37. Trabalhos anteriores do laboratório de Corden sugeriram que a ligação de Nrd1 ao seu RNA tem como alvo mudanças significativas quando as células são submetidas à falta de glicose28,38. Como tal, as células que crescem exponencialmente em meio contendo glicose (SD-TRP) foram deslocadas para o mesmo meio sem glicose (S-TRP) ao longo de um curso de tempo para monitorar mudanças dinâmicas nas interações Nrd1-RNA. As amostras foram retiradas e reticuladas na câmara Vari-X-linker (Figura 3A) antes do turno e depois de 1, 2, 4, 8, 14 e 20 min. O meio utilizado para o crescimento celular foi deliberadamente deficiente em triptofano para reduzir a absorção de UV por este aminoácido aromático. Note que o melhor é usar meio sintético que seja esterilizado por filtro, pois a autoclavagem do meio pode levar à caramelização dos açúcares. Isso reduz a eficiência da reticulação.
A Figura 4A mostra uma autorradiografia representativa de um experimento χCRAC. Observe que, neste exemplo, as amostras não foram agrupadas. Em vez disso, cada um foi executado individualmente no gel. Isso é recomendado para testes experimentais iniciais para mostrar que a proteína se liga efetivamente ao RNA em todos os momentos testados. Um sinal particularmente intenso foi observado no peso molecular esperado da RBP, representando a proteína ligada a RNAs radiomarcados muito curtos e não passíveis de sequenciamento. Portanto, o sinal do esfregaço acima dessa banda, que é a proteína reticulada a fragmentos de RNA mais longos, foi isolado. O fragmento foi cortado logo acima da banda proteica mais cerca de 30 kDa. A Figura 4B mostra um auto-radiograma após a excisão, com a proteína reticulada a RNAs curtos deixados no gel e o sinal previamente esfreguado, agora excisado.
Após a transcrição reversa, a biblioteca de cDNA deve ser amplificada por PCR. No entanto, a superamplificação da biblioteca deve ser evitada, pois pode introduzir viés para sequências preferencialmente amplificadas pela polimerase e gerar artefatos de PCR. Bibliotecas superamplificadas também contêm um grande número de sequências duplicadas que desperdiçam leituras no sequenciador. Para calcular o número ideal de ciclos de PCR para amplificação da biblioteca final, uma alíquota do cDNA foi amplificada através de qPCR usando os oligonucleotídeos P5 e BC. O primeiro ciclo em que a biblioteca atingiu o pico de fluorescência foi escolhido como contagem do ciclo de PCR. A Figura 4C fornece um exemplo de uma qPCR de uma biblioteca típica de cDNA, que produziu uma contagem de ciclo de pico de 16. Esse valor foi então utilizado para a PCR final do χPCAC. Para o processamento dos dados sequenciados, utilizamos um software previamente desenvolvido em nosso laboratório (pyCRAC) e o pipeline correspondente para análise dos dados cinéticos do CRAC (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Essas ferramentas de software de código aberto permitem a desmultiplexação e o corte dos dados, a remoção de duplicatas de PCR, a identificação de picos estatisticamente significativos, leituras de cluster em sequências contíguas e a identificação de motivos de ligação39. Mais detalhes sobre como essas ferramentas operam podem ser encontrados em suas respectivas páginas da Web.
Também começamos a desenvolver um protocolo χCRAC para células de mamíferos. A maioria das linhagens celulares de mamíferos é cultivada como uma monocamada e a bandeja em nosso reticulante com o saco permeável aos raios UV não é adequada para experimentos com células aderentes. Para superar esse problema, desenvolvemos uma etapa em que os usuários podem irradiar UV 1–2 placas de Petri (150 mm de diâmetro e 25 mm de profundidade) com células aderentes (Figura 3B). Como um primeiro teste, a eficiência do reticulante para células de mamíferos foi medida através de reticulação e captura de GFP-RBM7 marcada de forma estável usando anticorpos anti-GFP e uma purificação tradicional baseada em CLIP. Como mostrado na Figura 5A, o reticulante foi capaz de recuperar complexos proteína-RNA de células de mamíferos cultivadas como uma monocamada usando irradiação UV de 254 nm em eficiências comparáveis a um dispositivo de irradiação UV amplamente utilizado. No entanto, o material plástico padrão de cultura celular normalmente usado para experimentos de reticulação UV é impenetrável até 254 nm UV. Portanto, em nosso reticulador as células só receberiam irradiação da margem superior das lâmpadas UV. Para superar isso, desenvolvemos uma placa de Petri de quartzo permeável aos raios UV para crescimento celular e reticulação. O uso da cultura de quartzo mostrou recuperação robusta de complexos proteína-RNA com apenas 2 s de irradiação UV (Figura 5B). Quando combinados com métodos de captura de RBP para células de mamíferos, como as tecnologias CLIP, esses curtos tempos de reticulação são passíveis de cursos temporais para recuperar perfis espaço-temporais de ligação de RNA de RBPs em resposta a estresses genotóxicos ou depleções rápidas de fatores proteicos, ou em paralelo com a sincronização transcricional ou do ciclo celular.
A Figura 6 mostra vários exemplos dos dados Nrd1 processados pelo pipeline χCRAC. Esta figura foi preparada usando os arquivos bedgraph gerados pelo pipeline e o pacote python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), que projetamos para simplificar a criação de imagens de navegador genômico com qualidade de publicação dos dados. Os retângulos cinzentos representam regiões genômicas que expressaram RNAs não codificantes, como transcritos instáveis crípticos (CUTs), transcritos estáveis não caracterizados (SUTs)40 e transcritos instáveis sensíveis a Xrn1 (XUTs)41. Os dados da Figura 6 mostram que Nrd1 liga-se a muitos desses transcritos de RNA não codificantes, consistente com a ideia de que esta proteína está envolvida na degradação dessa classe de transcritos42. A Figura 6A mostra uma região de ~15 kb no cromossomo IV. Aqui houve um aumento significativo na ligação de Nrd1 aos transcritos que codificam os transportadores de glicose de alta afinidade HXT6 e HXT7, ambos os quais são upregulated durante a inanição de glicose. É provável que a terminação da transcrição pelo complexo NNS possa influenciar a cinética de indução desses genes durante a inanição de glicose. A Figura 6B mostra um exemplo de ligação cruzada de Nrd1 com a transcrição Imd3, que é conhecida por ser regulada por Nab343. Neste caso, os dados demonstraram uma redução significativa na ligação à falta de glicose. Trabalhos anteriores mostraram diminuição da ligação do Nab3 ao transcrito Tye7 durante a falta de glicose44. Consistente com essa observação, os dados do χCRAC sugerem que a ligação de Nrd1 diminuiu durante a inanição de glicose e a ligação cruzada de Nrd1 com Tye7 foi mais baixa após 8 min de estresse (Figura 4C). No entanto, parece que esse efeito foi apenas transitório, porque após 14 min de falta de glicose, a ligação de Nrd1 voltou aos níveis iniciais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo χCRAC. As cepas marcadas foram cultivadas até a densidade desejada. RBP indica proteína ligadora de RNA. Em seguida, uma amostra de referência foi coletada e reticulada com luz UV de 254 nm. As células restantes foram colhidas por filtração e, em seguida, rapidamente deslocadas para o meio indutor de estresse. Para o experimento χCRAC aqui descrito, amostras foram coletadas e reticuladas 1, 2, 4, 8, 14 e 20 min após o turno (1). A RBP de interesse foi então purificada usando uma purificação de afinidade em duas etapas altamente rigorosa (2). Em seguida, os RNAs reticulados capturados foram parcialmente digeridos com RNases, radiomarcados na extremidade 5' e adaptadores foram ligados a eles (3). Os adaptadores de 5' continham sequências de código de barras exclusivas "em leitura" para que as amostras individuais pudessem ser separadas bioinformaticamente após o sequenciamento. Os complexos RBP-RNA foram então eluídos, agrupados e precipitados em conjunto (4), resolvidos por SDS-PAGE e visualizados através de autorradiografia (5). Em seguida, um único corte de gel contendo o sinal radioativo logo acima da banda principal, ilustrado com caixa vermelha tracejada na imagem da autorradiografia, foi cortado do gel (5). As fatias de gel foram tratadas com protease K e o RNA foi posteriormente extraído (6), convertido em cDNAs e amplificado por PCR (7). A etapa de PCR introduziu códigos de barras adicionais (bloco amarelo introduzido pelo oligo P7) para que muitas bibliotecas pudessem ser multiplexadas em uma única faixa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figura 2: Reticulação e filtração a vácuo. (A) O reticulador. A suspensão da célula é despejada em um funil localizado no canto superior direito da máquina (veja também a Figura 3A para um close-up) e mantida em um saco transparente UV localizado na bandeja do meio. Este saco é flanqueado por duas persianas que permanecem fechadas até que o usuário instrua a máquina a iniciar a etapa de irradiação. As células são irradiadas com luz UV das bandejas acima e abaixo. A máquina vem fornecida com lâmpadas UV de 254 e 365 nm, sendo esta última aplicável para experimentos PAR-CLIP. A máquina é operada através de um painel touchscreen localizado no canto superior direito que permite controlar a dosagem UV ou o tempo de exposição. (B) Após a reticulação, as células são drenadas do lado esquerdo da máquina. As suspensões celulares são recuperadas através do vácuo e drenadas para um frasco de vidro, onde podem ser posteriormente despejadas em um dispositivo de filtragem a vácuo para a colheita. (C) Dispositivos de filtração a vácuo. Estes são abertos e fechados através de um clipe e um filtro é inserido entre ele. Quatro dispositivos de filtração foram usados em paralelo por séries temporais muito curtas para não perder tempo como resultado da troca de filtros. (D) Após a filtração, o sobrenadante do meio foi drenado em frascos para posterior descarte. Válvulas foram instaladas abaixo dos dispositivos de filtração a vácuo para manter o vácuo no sistema quando o filtro é removido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figura 3: Reticulação de células suspensas versus células aderentes. (A) O reticulador com a câmara de ligação Vari-X para células de suspensão. A cultura celular é despejada na entrada da amostra (funil) localizada no canto superior direito da bandeja. (B) Bandeja que pode conter placas de Petri de plástico ou quartzo para reticulação de células aderentes ou pequenos volumes de células de suspensão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figura 4: Preparação da biblioteca. (A) Exemplo de um auto-radiograma de um experimento χCRAC Nrd1-HTP. O sinal forte e concentrado representa a proteína reticulada a RNAs muito curtos, enquanto o esfregaço acima representa a proteína reticulada a RNAs de comprimento suficiente para sequenciamento. (B) O esfregaço foi excisado como mostrado em um auto-radiograma obtido após a excisão do gel. (C) Um qPCR representativo de uma biblioteca de cDNA χCRAC. Neste exemplo, a amplificação máxima do cDNA foi atingida em 16 ciclos. Assim, foram utilizados 16 ciclos para a amplificação final. A barra de erro representa o desvio padrão de três réplicas técnicas de qPCR. (D) Exemplo de uma imagem de fósforo de uma biblioteca de cDNA em gel de TBE a 6%. (E) análise do comprimento e da qualidade do cDNA a partir de eletroforese capilar baseada em chips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figura 5: Experimento iCLIP de teste de alta RNase para testar ligações cruzadas em células de mamíferos. São mostrados auto-radiogramas de experimentos iCLIP GFP-RBM7 que testaram a eficiência da recuperação de RNP em várias energias de reticulação. As imunoprecipitações foram realizadas utilizando anticorpos anti-GFP acoplados a esferas magnéticas em células reticuladas que expressavam de forma estável a GFP-RBM7. Os imunoprecipitados foram incubados com altas concentrações de RNase I para aparar os RNAs associados a comprimentos curtos e uniformes. As RNPs foram visualizadas por marcação de 32P e SDS-PAGE e migram como uma banda definida, próxima à migração da proteína não reticulada. A quantificação indica os resultados das análises densitométricas do sinal radiomarcado RBM7-RNA normalizado para o sinal anti-GFP western blot. (A) Curso de tempo de cross-linking do reticulador UVP comumente usado versus nosso reticulador (Vari-X-linker; VxL). (B) Curso de tempo de cross-linking do nosso cross-linker em quartzo (esquerda) e plástico (direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figura 6: Gráficos de exemplo de navegador de genoma mostrando o poder de χCRAC para mostrar a ligação temporal diferencial de Nrd1 a seus alvos. Cada caixa mostra gráficos para regiões genômicas individuais. As setas indicam em qual fita os genes estão codificados (seta apontando para a esquerda = menos fita; seta apontando para a direita = mais fita). Os pontos de tempo (min) são indicados por t0, t1, t2, etc nos eixos y de cada subparcela. Os algarismos romanos que indicam os cromossomos e as coordenadas são mostrados. (A) Após a privação de glicose, Nrd1 liga-se a dois transportadores de glicose de alta afinidade, HXT6 e HXT7, que são ambos upregulated nesta condição. (B) Observa-se que Nrd1 se liga a Imd3, um alvo já validado de Nab344, com intensidade reduzida após a falta de glicose. (C) A ligação de Nrd1 de Tye7 exibe uma natureza dinâmica e transitória, diminuindo após a falta de glicose ao mínimo após 8 min de estresse. No entanto, a ligação retorna subsequentemente aos níveis basais após 14 min. As leituras foram normalizadas para "leituras por milhão" (RPM; eixo y). As caixas cinzas indicam regiões que codificam RNAs não codificantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

A reticulação cinética e análise de cDNA é um método que permite investigar a dinâmica das interações proteína-RNA em células vivas em alta resolução temporal. Aqui, o protocolo é descrito em detalhes, incluindo o crescimento de células de levedura, reticulação UV, colheita, purificação de proteínas e etapas de preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração.

Monitorando a Dinâmica da Interação Proteína-RNA In Vivo em Alta Resolução Temporal Usando χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

4.8K visualizações.  University of Edinburgh. A reticulação cinética e análise de cDNA é um método que permite investigar a dinâmica das interações proteína-RNA em células vivas em alta resolução temporal. Aqui, o protocolo é descrito em detalhes, incluindo o crescimento de células de levedura, reticulação UV, colheita, purificação de proteínas e etapas de preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração.

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High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) data. The protocol presented here describes in detail how to obtain a near-atomic resolution structure starting from cryo-EM micrograph movies by guiding users through all steps of the single particle structure determination pipeline. These steps are controlled from the new SPHIRE graphical user interface and require minimum user intervention. Using this protocol, a 3.5 &#197; structure of TcdA1, a Tc toxin complex from Photorhabdus luminescens, was derived from only 9500 single particles. This streamlined approach will help novice users without extensive processing experience and a priori structural information, to obtain noise-free and unbiased atomic models of their purified macromolecular complexes in their native state.

This paper presents a protocol for processing cryo-EM images using the software suite SPHIRE. The present protocol can be applied for nearly all single particle EM projects that target near-atomic resolution.

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Bioquímica

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without labeling other than deuterium. In particular, neutron backscattering spectroscopy records the scattering signals at multiple scattering angles simultaneously and is well suited to study the dynamics of biological systems on the ps-ns timescale. By employing D2O-and possibly deuterated buffer components-the method allows monitoring of both center-of-mass diffusion and backbone and side-chain motions (internal dynamics) of proteins in liquid state.
Additionally, hydration water dynamics can be studied by employing powders of perdeuterated proteins hydrated with H2O. This paper presents the workflow employed on the instrument IN16B at the Institut Laue-Langevin (ILL) to investigate protein and hydration water dynamics. The preparation of solution samples and hydrated protein powder samples using vapor exchange is explained. The data analysis procedure for both protein and hydration water dynamics is described for different types of datasets (quasielastic spectra or fixed-window scans) that can be obtained on a neutron backscattering spectrometer.
The method is illustrated with two studies involving amyloid proteins. The aggregation of lysozyme into &#181;m sized spherical aggregates-denoted particulates-is shown to occur in a one-step process on the space and time range probed on IN16B, while the internal dynamics remains unchanged. Further, the dynamics of hydration water of tau was studied on hydrated powders of perdeuterated protein. It is shown that translational motions of water are activated upon the formation of amyloid fibers. Finally, critical steps in the protocol are discussed as to how neutron scattering is positioned regarding the study of dynamics with respect to other experimental biophysical methods.

Neutron backscattering spectroscopy offers a nondestructive and label-free access to the ps-ns dynamics of proteins and their hydration water. The workflow is presented with two studies on amyloid proteins: on the time-resolved dynamics of lysozyme during aggregation and on the hydration water dynamics of tau upon fiber formation.