Bu protokol, viral bir enfeksiyon sırasında fare periferik sinir sisteminde nöroinflamatuar yanıtların başlatılması ve geliştirilmesi nin incelenmesine olanak sağlar. Bu model ile, enfeksiyonlar periferik ve merkezi sinir sistemine çevre daha büyük bir mesafe seyahat, nöroinflamatuar yanıt kinetik maksimal bir değerlendirme sağlayan. Beş ila yedi haftalık anestezik C57BL/6 fareyi cerrahi bir ped üzerinde supine pozisyonuna yerleştirdikten sonra, pedal refleksine yanıt eksikliğini doğrulayın.
Ve 100-180 grit emery kurulu kullanın, yavaşça topuk ve tahta yaklaşık 20 geçer ile yürüyüş pedleri arasında bir arka ayak takımı glabrous deri aşındırmak için. Sonra yavaş yavaş stratum basale ortaya çıkarmak için aşınma ile ayrılmış stratum korneum soymak için ince forceps kullanın. Nazik karıştırma sonra, topikal abraded pad üzerine virüs inoculum uygun titre 20 mikrolitre uygulayın.
Sadece kontrol hayvanlarının aşılı ayak lıklarında orta ile sahte aşılar gerçekleştirin. Her uygulamadan sonra, 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir virüsün adsorpsiyonkolaylaştırmak için bir iğne mili ile hafifçe ayak takımı 10 kez ovmak. Abraded footpad kurutulduğunda, klinik takip ve örnekleme için tek tek kafeslere hayvanları yerleştirmeden önce farelerin sternal recumbency kadar izleme ile kurtarmak için izin verin.
Uygun deneysel zaman noktalarında, virüs kalp, akciğerler, dalak, pankreas, karaciğer, böbrekler ve mesane de dahil olmak üzere maruz organları toplamak buz üzerinde bireysel 1.5 mililitre mikrotüpler içine. Sonra topuk ve yürüyüş pedleri arasında abraded footpads hasat ve buz üzerinde bireysel 1,5 mililitremikrotüpler içine örnekleri yerleştirin. Daha sonra fareyi yatkın konuma getirin ve kürkü %70 etanolle ısla.
Vertebral kolon ortaya çıkarmak için, pelvis bölgesinde küçük bir kesi yapmak ve baş doğru arka ekstremitelerden deri şerit. Ön ve arka uzuvları çıkarmak için, paralel ve her iki tarafta spinal kolon yakın kesmek için makas kullanın. Ve kafatasının tabanındaki kafayı çıkar.
Ön kemik foramen magnum kafatası açmak için makas kullanın. Ve kafatasını yanal bir yöne çekmek için forceps kullanın. Sonra yavaşça beyin dışarı kepçe ve buz üzerinde 1.5 mililitrelik mikrotüp içine beyin yerleştirmek için forceps kullanın.
Kas, yağ ve yumuşak doku omurilik temizlemek ve kuyruk kaldırmak için kavisli makas kullanın. Daha sonra bozulmamış omuriliğini en fazla üç saat boyunca 15 mililitrelik steril buz gibi pbs tüpüne yerleştirin. Diseksiyondan sonra, kalan yumuşak dokunun çıkarılmasını sağlamak için omuriliği bir doku kültürü yemeğine aktarın.
S2, L1 ve T1 omurları omurilik yoluyla üç enine kesik yapmak için bir jilet kullanın. Parçaları steril buz gibi PBS içeren 15 milimetrelik tek tek yemeklere aktarın. Daha sonraki analizler için segmentlerin kökenlerini izlemek ve işaretlemek.
Daha sonra, bir segment dorsal tarafı kadar güvenli ve iki eşit yarıya sütun bölmek için orta hat üzerinden tek, uzunlamasına kesilmiş yapmak için bir jilet kullanın forceps kullanın. Omurganın sol ve sağ taraflarını ayırt edebilmek için orijinal yönde taze, steril buz gibi PBS içeren yeni bir Petri kabına her iki yarım yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskop altında, yavaşça kaudal yönde bir rostral vertebral sütunun her yarısından omurilik soymak için ince forceps kullanın.
Daha sonra her iki omurilik yarımlarını buz üzerinde 500 mikrolitre steril buz gibi PBS içeren tek tek 1,5 mililitrelik mikrotüplere yerleştirin. Dorsal kök ganglion ortaya çıkarmak için, yavaşça diğer omurilik bir tarafında menenjler kaldırın. Ve açıkta kalan beyaz omurilik sinirini omurilikten çıkar.
Yuvarlak hasat, omurga segmentinden şeffaf dorsal kök ganglion içine 15 buz gibi PBS bir 15 milimetre Petri çanak. Ve ipsilateral ve kontrlateral dorsal kök ganglion toplamak gibi sadece gösterdi. Sadece gösterildiği gibi diğer iki spinal kolon segmentlerinden spinal sinir ve dorsal kök ganglion hasat sonra, yüksek hızda doku tüm tüpleri santrifüj.
Daha sonra süpernatantları aspire edin ve numuneleri sıvı nitrojende flaş dondurun ve homojenhale gelene kadar eksi 80 derecede saklayın. Doku homojenizasyonu için, her numunenin 100 miligramını tartmadan önce donmuş doku tüplerini buz üzerinde eritin. Steril boncuklar ve 500 mikrolitre radyoimmünopreyağış tofçuk tamponu içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, iki dakika boyunca saniyede 20 döngü, bir dakika bekleme süresi ve ek bir iki dakika için saniyede 20 döngüleri bir homogenizer oda sıcaklığında dokuları bozmak. Homojenizasyon ikinci tursonra, yeni bir uygun etiketli tüp içine her supernatant 500 mikrolitre aktarmadan önce yüksek hızda dokuları santrifüj. Aşağı analize kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Aşınma yeri kontrol ayak takımı görünür. Ve iyileşme sürecinin bir parçası olarak aşınma yerinde bir kabuk oluşturmak için tipiktir. Buna karşılık, fareler psödorabies ile aşılanmış, şişme ve kızarıklık ile karakterizedir insancıl ucunda ayak takımı ciddi bir iltihap göstermek.
Aşılama pediye ve dorsal kök ganglion histopatolojik inceleme psödorabies enfekte ayak bölümleri içinde epidermal nekroz ve şiddetli dermal inflamasyon ortaya koymaktadır. Nötrofilin infiltrasyonu da psödorabi enfekte DRG kesitlerinde gözlenmektedir. G-CSF protein ekspresyonunda önemli bir artış, enfeksiyon sonrası yedi ve 82 saatlik kontrollere kıyasla, enfekte olmuş farelerin pediye ve dorsal kök ganglion'unda ölçülür.
Önemli G-CSF düzeyleri de kontrollere göre spinal kord, beyin, kalp ve psödokuyabiler enfekte farelerin karaciğer dokularında 82 saatlik post-enfeksiyon gözlenir. Ayrıca, 24 saat post-enfeksiyon dan başlayarak psödorabis enfekte farelerin tüm test dokularında IL-6 önemli düzeyde tespit edilir. Bir moribund durumda, psödorabies ayak takımı tespit edildi, dorsal kök ganglion, omurilik, ve beyin.
Psödorabies enfekte farelerde dorsal kök ganglion nöronlarında psuedorabies glikoprotein gB yüksek sitoplazmik ekspresyonu ile. Başarılı bir enfeksiyon sağlamak için, bir sütunda virüs damlacık abraded ayak takımı düşmez önemlidir. Bu hayvan modeli viral kaynaklı periferik nöropatileri önlemek için anti-inflamatuar ve antiviral ilaçların etkinliğini test etmek için platform hizmet edebilir.
