Данный протокол позволяет изучать инициирование и развитие нейровоспламеняящих реакций в периферической нервной системе мыши во время вирусной инфекции. С помощью этой модели инфекции промещают большее расстояние от периферии до периферической и центральной нервной системы, что позволяет получить максимальную оценку кинетики нейровоспламеняющий ответ. После размещения пять-семь недель обезболивающее C57BL/6 мыши в положении на спине на хирургической площадке, подтвердить отсутствие ответа на педаль рефлекс.
И использовать от 100 до 180 песка Эмери борту, чтобы мягко abrade глабрузной кожи одной задней подножки между пяткой и пешеходные прокладки с около 20 проходов доски. Затем используйте тонкие миппы, чтобы медленно отслаить роговицу слоя, отделенную ссадиной, чтобы разоблачить слой базале. После нежного смешивания, местно нанесите 20 микролитров соответствующего titer инокулума вируса на абрадированную подножку.
Проводить макетные прививки со средними только в абраденых подножких контрольных животных параллельно. После каждого применения, осторожно руб подножку 10 раз с валом иглы, чтобы облегчить adorption вируса каждые 10 минут в течение 30 минут. Когда абрадированная подножка высушена, позвольте мышам восстановиться с мониторингом до стернальной лежачих мест перед размещением животных в отдельных клетках для клинического наблюдения и отбора проб.
В соответствующие экспериментальные точки времени, собирать вирус подвергаются органов, в том числе сердца, легких, селезенки, поджелудочной железы, печени, почек и мочевого пузыря в отдельных 1,5 миллилитров микротрубки на льду. Затем соберем абраденые подножки между пяткой и пешеходными площадками и поместите образцы в отдельные микротрубочки 1,5 миллилитров на льду. Далее поместите мышь в положение склонных и мокрый мех с 70% этанола.
Чтобы разоблачить позвоночник, сделайте небольшой разрез в области таза и смойте кожу от задних конечностей к голове. Чтобы удалить переконд и задние конечности, используйте ножницы, чтобы прорезать параллельно и близко к позвоночнику с обеих сторон. И удалить голову у основания черепа.
Используйте ножницы, чтобы открыть череп от foramen magnum до лобной кости. И используйте типсы, чтобы открыть череп в боковом направлении. Затем используйте типсы, чтобы аккуратно вычерпыть мозг и поместить мозг в 1,5 миллилитров микротрубки на льду.
Используйте изогнутые ножницы для очистки позвоночника мышц, жира и мягких тканей, а также удалить хвост. Затем поместите нетронутый позвоночник в 15-миллилитровую трубку стерильного ледяного PBS на льду не более трех часов. После вскрытия перенесите спинной мозг в блюдо культуры тканей, чтобы удалить оставшиеся мягкие ткани.
Используйте лезвие бритвы, чтобы сделать три поперечных прорезает позвоночник на S2, L1, и T1 позвонков. Перенесите кусочки в отдельные 15-миллиметровые блюда, содержащие стерильный ледяной PBS. Отслеживание и маркировка происхождения сегментов для более длительного анализа.
Далее, используйте щипцы для обеспечения одного сегмента спинной стороны вверх и использовать лезвие бритвы, чтобы сделать один, продольный сократить через середину, чтобы разделить столбец на две равные половинки. Поместите обе половинки в новую чашку Петри, содержащую свежий, стерильный ледяной PBS в первоначальной ориентации, чтобы иметь возможность различать левую и правую стороны позвоночника. Под рассечением микроскопа используйте тонкие типсы, чтобы аккуратно очистить спинной мозг от каждой половины позвоночного столба в ростральном и хвостовом направлении.
Затем поместите обе половинки спинного мозга в отдельные микротрубки 1,5 миллилитров, содержащие 500 микролитров стерильного ледяного PBS на льду. Чтобы разоблачить спинной корневой ганглий, аккуратно удалите околение с одной стороны позвоночника на другую. И вытащите открытый белый спинной нерв из позвоночника.
Урожай круглый, прозрачный спинной корень ганглия из позвоночника сегмента в 15 миллиметров Петри блюдо ледяной PBS. И собирать ипсилатеральный и контралатеральный спинной корневой ганглион, как только что продемонстрировано. После сбора спинного нерва и спинного корня ганглиона из двух других сегментов позвоночника, как только что продемонстрировано, центрифуга всех трубок ткани на высокой скорости.
Затем аспирировать супернатанты и флэш-заморозить образцы в жидком азоте, и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до гомогенизации. Для гомогенизации тканей, оттаивать трубки замороженных тканей на льду, прежде чем взвешивать 100 миллиграммов каждого образца. Передача в двухмилитровую микроцентрифугированную трубку, содержащую стерильные бусы и 500 микролитров буфера анализа радиоиммунопреципиентации.
Затем нарушить ткани при комнатной температуре на гомогенизатор на 20 циклов в секунду в течение двух минут, а затем одну минуту ожидания период, и 20 циклов в секунду в течение дополнительных двух минут. После второго раунда гомогенизации центрифуга тканей на высокой скорости перед передачей 500 микролитров каждого супернатанта в новую соответствующую помеченную трубку. Хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию до анализа ниже по течению.
Место ссадины видно на подножку управления. И это типично для коры, чтобы сформировать в месте ссадины как часть процесса заживления. В отличие от этого, мыши, привитые псевдорабиями, демонстрируют сильное воспаление подножки на гуманной конечной точке, которая характеризуется отеком и покраснением.
Гистопатологическое обследование привитой подножки и спинного корня ганглиона выявляет эпидермальный некроз и тяжелое дермальное воспаление в псевдорабиях инфицированных участков стопы. Инфильтрация нейтрофилов также наблюдается в псевдорабиях инфицированных DRG разделов. Значительное увеличение экспрессии белка G-CSF измеряется в подножке и спинном корневом ганглии псевдорабий инфицированных мышей по сравнению с контролем как на семи, так и на 82-часовой пост-инфекции.
Значительные уровни G-CSF также наблюдаются на 82-часовой пост-инфекции в спинном мозге, головном мозге, сердце, и печени тканей псевдорабии инфицированных мышей по сравнению с контроля. Кроме того, значительные уровни ИЛ-6 обнаруживаются во всех проверенных тканях псевдорабий инфицированных мышей, начиная с 24-часовой пост-инфекции. В умирающем состоянии псевдорабии были обнаружены в подножки, спинном корневом ганглии, спинном мозге и головном мозге.
При высокой цитоплазмической экспрессии psuedorabies гликопротеин GB в нейронах спинного корня ганглиона у псевдорабов инфицированных мышей. Чтобы обеспечить успешную инфекцию, важно, чтобы капля вируса в столбце не упала с ссадины. Эта модель животных может служить платформой для проверки эффективности противовоспалительных и противовирусных препаратов для предотвращения вирусных индуцированных периферических невропатий.
