Ce protocole permet l’étude de l’initiation et du développement des réponses neuroinflammatory dans le système nerveux périphérique de souris pendant une infection virale. Avec ce modèle, les infections voyagent une plus grande distance de la périphérie au système nerveux périphérique et central, permettant une évaluation maximale de la cinétique de la réponse neuroinflammatory. Après avoir placé la souris C57BL/6 anesthésiée de cinq à sept semaines en position supine sur un bloc chirurgical, confirmer un manque de réponse au réflexe de la pédale.
Et utilisez une planche d’émeri de 100 à 180 grains, pour abrader doucement la peau glabre d’un pied arrière entre le talon et les coussinets de marche avec environ 20 passages de la planche. Ensuite, utilisez des forceps fins pour décoller lentement la strate cornée détachée par l’abrasion pour exposer la basale strate. Après un mélange doux, appliquer topiquement 20 microlitres du litre approprié d’inoculum de virus sur le pavé abrassé.
Effectuer des inoculations simulées avec moyen seulement dans les pavés abrasés des animaux de contrôle en parallèle. Après chaque application, frottez doucement le footpad 10 fois avec l’arbre d’une aiguille pour faciliter l’adsorption du virus toutes les 10 minutes pendant 30 minutes. Lorsque le pavé abradé est séché, permettre aux souris de récupérer avec surveillance jusqu’à la récumbence sternale avant de placer les animaux dans des cages individuelles pour un suivi clinique et l’échantillonnage.
Aux moments expérimentaux appropriés, recueillir les organes exposés au virus, y compris le cœur, les poumons, la rate, le pancréas, le foie, les reins et la vessie en microtubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, récoltez les coussinets abrasés entre le talon et les coussinets de marche et placez les échantillons dans des microtubes individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, placez la souris en position couchée et mouillez la fourrure avec 70% d’éthanol.
Pour exposer la colonne vertébrale, faire une petite incision dans la région du bassin et dépouiller la peau des membres postérieurs vers la tête. Pour enlever les membres avant et arrière, utilisez des ciseaux pour couper parallèlement à la colonne vertébrale des deux côtés et à proximité. Et retirez la tête à la base du crâne.
Utilisez les ciseaux pour ouvrir le crâne du magnum foramen à l’os frontal. Et utilisez des forceps pour ouvrir le crâne dans une direction latérale. Ensuite, utilisez les forceps pour ramasser doucement le cerveau et placer le cerveau dans un microtube de 1,5 millilitre sur la glace.
Utilisez des ciseaux incurvés pour nettoyer la colonne vertébrale des muscles, des graisses et des tissus mous, et enlever la queue. Placez ensuite la colonne vertébrale intacte dans un tube de 15 millilitres de PBS stérile glacé sur la glace pendant au plus trois heures. Après la dissection, transférer la moelle épinière dans un plat de culture tissulaire pour permettre l’enlèvement de tout tissu mou restant.
Utilisez une lame de rasoir pour faire trois coupes transversales à travers la colonne vertébrale aux vertèbres S2, L1 et T1. Transférer les morceaux dans des plats individuels de 15 millimètres contenant du PBS froid comme glace stérile. Garder une trace et marquer les origines des segments pour une analyse ultérieure.
Ensuite, utilisez des forceps pour fixer un côté dorsale du segment vers le haut et utilisez une lame de rasoir pour faire une seule coupe longitudinale à travers la ligne médiane pour diviser la colonne en deux moitiés égales. Placez les deux moitiés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS frais et stérile glacé dans l’orientation originale pour pouvoir distinguer les côtés gauche et droit de la colonne vertébrale. Sous un microscope disséquant, utiliser des forceps fins pour peler doucement la moelle épinière de chaque moitié de la colonne vertébrale dans une direction rostrale à caudale.
Placez ensuite les deux moitiés de moelle épinière dans des microtubes individuels de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS stérile glacé sur la glace. Pour exposer le ganglion de racine dorsale, retirez doucement les méninges d’un côté de la colonne vertébrale à l’autre. Et retirez le nerf spinal blanc exposé de la colonne vertébrale.
Récoltez le ganglion de racines dorsales rond et transparent du segment de la colonne vertébrale en une boîte de Pétri de 15 millimètres de PBS glacé. Et recueillir le ganglion de racine dorsale ipsilateral et contralatéral comme vient de le démontrer. Après avoir récolté le nerf spinal et le ganglion de racine dorsale des deux autres segments de colonne vertébrale comme juste démontré, centrifugeuse tous les tubes du tissu à grande vitesse.
Ensuite, aspirez les supernatants et clignotez les échantillons dans de l’azote liquide, et stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à homogénéisation. Pour l’homogénéisation tissulaire, décongeler les tubes de tissu congelé sur la glace avant de peser 100 milligrammes de chaque échantillon. Transférer dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres contenant des perles stériles et 500 microlitres de tampon d’essai de radioimmunoprécipation.
Ensuite, perturbez les tissus à température ambiante sur un homogénéisant à 20 cycles par seconde pendant deux minutes, suivi d’une période d’attente d’une minute, et de 20 cycles par seconde pendant deux minutes supplémentaires. Après le deuxième cycle d’homogénéisation, centrifugez les tissus à grande vitesse avant de transférer 500 microlitres de chaque supernatant dans un nouveau tube dûment étiqueté. Conserver à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse en aval.
Le site de l’abrasion est visible dans le pavé de contrôle. Et il est typique qu’une croûte se forme au site d’abrasion dans le cadre du processus de guérison. En revanche, les souris inoculées avec des pseudorabies, démontrent une inflammation grave du footpad au point final humain qui est caractérisé par le gonflement et la rougeur.
L’examen histopathologique du footpad inoculé et du ganglion dorsale de racine indique la nécrose épidermique et l’inflammation cutanée grave dans les sections infectées de pied de pseudorabies. L’infiltration des neutrophiles est également observée dans les pseudorabies infectées sections DRG. Une augmentation significative de l’expression de protéine de G-CSF est mesurée dans le footpad et le ganglion dorsale de racine des souris infectées de pseudorabies comparées aux contrôles à la fois à sept et 82 heures après l’infection.
Des niveaux significatifs de G-CSF sont également observés à 82 heures après infection dans la moelle épinière, le cerveau, le coeur, et les tissus de foie des souris infectées de pseudorabies comparées aux contrôles. En outre, des niveaux significatifs d’IL-6 sont détectés dans tous les tissus testés de souris infectées par pseudorabies à partir de 24 heures après l’infection. Dans un état moribond, des pseudorabies ont été détectées dans le footpad, le ganglion dorsale de racine, la moelle épinière, et le cerveau.
Avec l’expression cytoplasmique élevée de psuedorabies glycoprotéine gB dans les neurones du ganglion dorsale de racine chez les souris infectées de pseudorabies. Pour assurer une infection réussie, il est important que la gouttelette de virus dans une colonne ne tombe pas du pavé abrassé. Ce modèle animal peut servir de plate-forme pour tester l’efficacité des anti-inflammatoires et des antiviraux afin de prévenir les neuropathies périphériques induites par le virus.
