このプロトコルは、ウイルス感染時のマウス末梢神経系における神経炎症反応の開始および発達の研究を可能にする。このモデルでは、感染症は周辺から末梢および中枢神経系までより大きな距離を移動し、神経炎症反応の運動学の最大評価を可能にする。5~7週齢の麻酔付きC57BL/6マウスを手術パッドの上の立場に置いた後、ペダル反射への応答の欠如を確認する。
そして、100〜180グリットエメリーボードを使用して、ヒールとボードの約20パスでヒールとウォーキングパッドの間の1つの後ろ足パッドのグラブロウススキンを優しくブラドします。その後、細かい鉗子を使用して、摩耗によって切り離された角質層をゆっくりと剥がし、地層のバサレを露出させる。穏やかな混合の後、局所的に、アトワードフットパッドにウイルス接種の適切なチターの20マイクロリットルを適用する。
コントロール動物の吸い込んだフットパッドでのみ、培地で模擬接種を並行して行います。各アプリケーションの後、10分ごとにウイルスの吸着を容易にするために針のシャフトでフットパッドを10回軽くこすり、30分間します。ブラッド付きフットパッドを乾燥させると、マウスは胸骨の不順までモニタリングして回復してから、動物を個々のケージに入れて臨床後処理およびサンプリングを行う。
適切な実験時点で、ウイルスに曝された臓器を収集します, 心臓を含みます, 肺, 脾臓, 膵臓, 肝臓, 腎臓, 氷上の個々の 1.5 ミリリットルマイクロチューブに.その後、ヒールとウォーキングパッドの間の摩耗したフットパッドを収穫し、サンプルを氷の上の個々の1.5ミリリットルマイクロチューブに入れます。次に、マウスを起こしやすい位置に置き、70%エタノールで毛皮を濡らします。
椎骨柱を露出するには、骨盤の領域に小さな切開を行い、後肢から頭部に向かって皮膚を剥ぎ取る。前肢と後肢を取り除くためには、はさみを使用して両側の脊柱と平行に切断し、両側の脊柱に近い。そして、頭蓋骨の基部の頭を取り除きます。
はさみを使用して、頭蓋のマグナムから前頭骨まで頭蓋骨を開きます。そして、頭蓋骨を横方向に引っ張るために鉗子を使用してください。その後、鉗子を使用して脳を優しくすくい取り、脳を氷の上の1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れる。
湾曲したはさみを使用して、筋肉、脂肪、軟部組織の脊柱をきれいにし、尾を取り除きます。その後、無傷の脊柱を氷の上の無菌氷冷PBSの15ミリリットルチューブに3時間以下に入れます。解剖後、脊髄を組織培養皿に移し、残りの軟部組織を除去する。
カミソリの刃を使用して、S2、L1、およびT1椎骨の脊柱を3回横切ります。滅菌氷冷PBSを含む個々の15ミリメートルの皿に作品を転送します。後で解析するために、セグメントの原点を追跡し、マーキングします。
次に、鉗子を使用して1つのセグメント背側を固定し、カミソリの刃を使用して、正中線を通る単一の縦方向のカットダウンを行い、列を2つの等しい半分に分割します。背骨の左右を区別できるように、新鮮な無菌の氷冷PBSを含む新しいペトリ皿に両方の半分を置きます。解剖顕微鏡の下で、細かい鉗子を使用して、脊椎柱の各半分から小道部の脊髄をそっと剥がし、尾骨方向に剥がします。
その後、500マイクロリットルの無菌氷冷PBSを含む個々の1.5ミリリットルマイクロチューブに両方の脊髄半分を氷の上に置きます。背骨根神経節を露出させるために、脊柱の片側からもう一方の側に髄膜をそっと取り除く。そして、露出した白い脊髄神経を脊柱から引き出します。
円形の透明な背根神経節を脊椎セグメントから氷冷PBSの15ミリメートルペトリ皿に収穫します。そして、ちょうど実証したように、イプシラショナルと対側の後側の根神経節を収集します。ちょうど実証したように、他の2つの脊柱セグメントから脊髄神経および後根神経節を収穫した後、遠心分離機組織のすべての管を高速で。
その後、上清を吸引し、液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズし、均質化するまでマイナス80°Cで保存します。組織均質化のために、各サンプルの100ミリグラムを計量する前に氷上の凍結組織のチューブを解凍します。滅菌ビーズと500マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイバッファーを含む2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移管。
次に、ホモジナイザーの室温で2分間毎秒20サイクル、続いて1分間の待ち時間、さらに2分間毎秒20サイクルで組織を破壊する。均質化の第2ラウンド後、各上清の500マイクロリットルを新しい適切にラベル付けされたチューブに移す前に、組織を高速で遠心分離します。ダウンストリーム分析までマイナス20°Cで保管してください。
摩耗の部位は、コントロールフットパッドに表示されます。そして、癒しのプロセスの一環として、摩耗部位で地殻が形成されるのが典型的です。対照的に、偽狂犬病を接種したマウスは、腫脹および発赤を特徴とする人道的エンドポイントにおけるフットパッドの重篤な炎症を示す。
接種されたフットパッドおよび背部根神経節の病理組織学的検査は、偽狂犬病感染した足の切片内の表皮壊死および重度の真皮炎症を明らかにする。好中球の浸潤は、DRG切片に感染した偽狂犬病でも観察される。G-CSFタンパク質発現の有意な増加は、感染後7時間および82時間の両方のコントロールと比較して、偽狂病感染マウスのフットパッドおよび背部根神経節で測定される。
有意なG-CSFレベルは、対照と比較して、マウスに感染した偽狂犬病の脊髄、脳、心臓、および肝臓組織における感染後82時間で観察される。さらに、感染後24時間から始まる偽狂病感染マウスの全ての試験組織において、IL-6の有意なレベルが検出される。モリバンド状態では、フットパッド、背根神経節、脊髄、および脳に偽狂病が検出された。
偽狂犬病感染マウスにおける後根神経節のニューロンにおけるプロデラトラビクス糖タンパク質gBの高い細胞質発現を用いた。感染を確実にするためには、カラム内のウイルスの液滴が、手をつすれたフットパッドから落ちないようにすることが重要です。この動物モデルは、ウイルス誘導末梢神経障害を予防するために抗炎症薬および抗ウイルス薬の有効性を試験するプラットフォームを提供し得る。
