Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Einleitung und Entwicklung von neuroinflammatorischen Reaktionen im peripheren Nervensystem der Maus während einer Virusinfektion. Mit diesem Modell bewegen sich Infektionen einen größeren Abstand von der Peripherie zum peripheren und zentralen Nervensystem, was eine maximale Beurteilung der Kinetik der neuroinflammatorischen Reaktion ermöglicht. Nachdem Sie die fünf bis sieben Wochen alte anästhesierte C57BL/6-Maus in die Rückenlage auf einem chirurgischen Pad gelegt haben, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflexe.
Und verwenden Sie ein 100 bis 180 Grit Emery Board, um sanft die glabrous Haut eines Hinterfußpolsters zwischen der Ferse und Wanderpads mit etwa 20 Pässen des Brettes abzuschleifen. Dann verwenden Sie feine Zangen, um langsam das durch den Abrieb abgelöste Stratum corneum abzuziehen, um den Stratum basale freizulegen. Nach sanftem Mischen 20 Mikroliter des entsprechenden Virusinokulums totopisch auf das abgeriebene Fußpolster auftragen.
Führen Sie Scheinimpfungen mit Medium nur in den abgeriebenen Fußpolstern von Kontrolltieren parallel durch. Nach jeder Anwendung, reiben Sie das Fußpolster 10 Mal mit der Welle einer Nadel, um die Adsorption des Virus alle 10 Minuten für 30 Minuten zu erleichtern. Wenn das abgeriebene Fußpolster getrocknet ist, erlauben Sie den Mäusen, sich mit Derastalebissbisz zu erholen, bevor sie die Tiere zur klinischen Nachbeobachtung und Probenahme in einzelne Käfige legen.
Zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten sammeln Sie die virusexponierten Organe, einschließlich Herz, Lunge, Milz, Bauchspeicheldrüse, Leber, Nieren und Blase, in einzelne 1,5 Milliliter Mikroröhren auf Eis. Dann ernten Sie die abgeriebenen Fußpolster zwischen Ferse und Gehpolster und legen Sie die Proben in einzelne 1,5 Milliliter Mikroröhren auf Eis. Als nächstes legen Sie die Maus in die anfällige Position und befeuchten Sie das Fell mit 70% Ethanol.
Um die Wirbelsäule freizulegen, machen Sie einen kleinen Schnitt im Bereich des Beckens und streifen Sie die Haut von den Hinterbeinen zum Kopf. Um die Vorder- und Hinterbeine zu entfernen, verwenden Sie eine Schere, um parallel zur Wirbelsäule auf beiden Seiten parallel zu schneiden und zu schließen. Und entfernen Sie den Kopf an der Basis des Schädels.
Verwenden Sie die Schere, um den Schädel vom Foramen magnum bis zum Frontalknochen zu öffnen. Und verwenden Sie Zangen, um den Schädel in eine seitliche Richtung zu ziehen. Dann verwenden Sie die Zange, um das Gehirn sanft auszuhöhlen und das Gehirn in ein 1,5 Milliliter Mikrotube auf Eis zu legen.
Verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um die Wirbelsäule von Muskel, Fett und Weichgewebe zu reinigen und den Schwanz zu entfernen. Dann legen Sie die intakte Wirbelsäule in eine 15 Milliliter Tube steriler eiskalter PBS für nicht mehr als drei Stunden auf Eis. Nach der Zerlegung, übertragen Sie das Rückenmark in eine Gewebekulturschale, um die Entfernung von restlichem Weichgewebe zu ermöglichen.
Verwenden Sie eine Rasierklinge, um drei Querschnitte durch die Wirbelsäule an den Wirbeln S2, L1 und T1 zu machen. Übertragen Sie die Stücke in einzelne 15-Millimeter-Geschirr mit sterilem eiskaltem PBS. Verfolgen und Markieren der Ursprünge der Segmente für eine spätere Analyse.
Als nächstes verwenden Sie Zangen, um ein Segment dorsale Seite nach oben zu sichern und verwenden Sie eine Rasierklinge, um eine einzelne, längs geschnitten durch die Mittellinie zu machen, um die Säule in zwei gleiche Hälften zu teilen. Legen Sie beide Hälften in eine neue Petrischale mit frischem, sterilem eiskaltem PBS in der ursprünglichen Ausrichtung, um die linke und rechte Seite der Wirbelsäule unterscheiden zu können. Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop feine Zangen, um das Rückenmark vorsichtig aus der jeder Hälfte der Wirbelsäule in rostraler bis kaudaler Richtung zu schälen.
Dann legen Sie beide Rückenmarkshälften in einzelnen 1,5 Milliliter Mikroröhren mit 500 Mikroliter sterilen eiskalten PBS auf Eis. Um das dorsale Wurzelganglion freizulegen, entfernen Sie vorsichtig die Hirngespinst von einer Seite der Wirbelsäule auf die andere. Und ziehen Sie den freiliegenden weißen Spinalnerv aus der Wirbelsäule.
Ernten Sie das runde, transparente Rückenwurzelganglion aus dem Wirbelsäulensegment in eine 15 Millimeter lange Petrischale aus eiskaltem PBS. Und sammeln Sie die ipsilaterale und kontralaterale dorsale Wurzel Ganglion, wie gerade gezeigt. Nach der Ernte des Spinalnervs und des Rückenwurzelgangliens aus den beiden anderen Wirbelsäulensegmenten, wie gerade gezeigt, zentrifugieren alle Geweberöhren mit hoher Geschwindigkeit.
Dann die Überräube ansaugen und die Proben in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Homogenisierung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Für die Gewebehomogenisierung die Rohre des gefrorenen Gewebes auf Eis auftauen, bevor Sie 100 Milligramm jeder Probe auswiegen. Transfer in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit sterilen Perlen und 500 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer.
Als nächstes stören Sie das Gewebe bei Raumtemperatur auf einem Homogenisator bei 20 Zyklen pro Sekunde für zwei Minuten, gefolgt von einer einminütigen Wartezeit und 20 Zyklen pro Sekunde für weitere zwei Minuten. Nach der zweiten Homogenisierungsrunde zentrifugieren Sie das Gewebe mit hoher Geschwindigkeit, bevor Sie 500 Mikroliter jedes Überstandes in ein neues entsprechend beschriftetes Rohr übertragen. Bei minus 20 Grad Celsius bis zur nachgelagerten Analyse lagern.
Der Abriebort ist im Steuerfußpad sichtbar. Und es ist typisch, dass sich eine Kruste an der Abriebstelle als Teil des Heilungsprozesses bildet. Im Gegensatz dazu zeigen Mäuse, die mit Pseudorabige geimpft sind, eine schwere Entzündung des Fußpolsters am humanen Endpunkt, die durch Schwellung und Rötung gekennzeichnet ist.
Die histopathologische Untersuchung des geimpften Fußpolsters und des dorsalen Wurzelgangliens zeigt epidermale Nekrose und schwere dermale Entzündung enthoben in den Pseudorabi-infizierten Fußabschnitten. Die Infiltration von Neutrophilen wird auch in Pseudorabi-infizierten DRG-Abschnitten beobachtet. Eine signifikante Zunahme der G-CSF-Proteinexpression wird im Fußpad und dorsalen Wurzelganglien von Pseudorabi-infizierten Mäusen gemessen, verglichen mit Kontrollen sowohl bei sieben- als auch 82-stündigen Nachinfektionen.
Signifikante G-CSF-Spiegel werden auch bei 82-Stunden-Post-Infektion im Rückenmark beobachtet, Gehirn, Herz, und Lebergewebe von Pseudorabi infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Darüber hinaus werden signifikante Konzentrationen von IL-6 in allen getesteten Geweben von Pseudotollwut-infizierten Mäusen ab 24 Stunden nach der Infektion nachgewiesen. In einem moribunden Zustand wurden Pseudotollwut im Fußpolster, dorsalen Wurzelganglien, Rückenmark und Gehirn nachgewiesen.
Mit der hohen zytoplasmatischen Expression von Psuedorabies Glykoprotein gB in den Neuronen des dorsalen Wurzelgangliens bei Pseudorabi-infizierten Mäusen. Um eine erfolgreiche Infektion zu gewährleisten, ist es wichtig, dass das Tröpfchen des Virus in einer Säule nicht vom abgeriebenen Fußpolster fällt. Dieses Tiermodell kann Plattform dienen, um die Wirksamkeit von entzündungshemmenden und antiviralen Medikamenten zu testen, um virale periphere Neuropathien zu verhindern.
