Questo protocollo consente lo studio dell'iniziazione e dello sviluppo di risposte neuroinfiammatorie nel sistema nervoso periferico del topo durante un'infezione virale. Con questo modello, le infezioni percorreno una maggiore distanza dalla periferia al sistema nervoso periferico e centrale, consentendo una valutazione massima della cinetica della risposta neuroinfiammatoria. Dopo aver posizionato il mouse C57BL/6 anestetizzato di cinque-sette settimane nella posizione supina su un cuscinetto chirurgico, confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale.
E usa una tavola emery da 100 a 180 graniglia, per abrasare delicatamente la pelle glabrata di un piede posteriore tra il tallone e i cuscinetti da pass con circa 20 passaggi della tavola. Quindi utilizzare forcep fini per staccare lentamente lo strato corneo staccato dall'abrasione per esporre lo strato basale. Dopo una miscelazione delicata, applicare topicamente 20 microlitri del tazzo appropriato dell'inoculo del virus sul peduncolo abraso.
Effettuare finte inoculazioni con mezzo solo nei pedoni abrasi degli animali di controllo in parallelo. Dopo ogni applicazione, strofinare delicatamente il pedone 10 volte con l'albero di un ago per facilitare l'adsorbimento del virus ogni 10 minuti per 30 minuti. Quando il pedante abraso viene asciugato, consentire ai topi di riprendersi con il monitoraggio fino a quando la reclinanza sternale prima di mettere gli animali in gabbie individuali per il follow-up clinico e il campionamento.
Nei punti di tempo sperimentali appropriati, raccogliere gli organi esposti al virus, inclusi il cuore, i polmoni, la milza, il pancreas, il fegato, i reni e la vescica in singoli microtubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Quindi raccogliere i pedoni abrasi tra il tallone e i cuscinetti da passeggio e posizionare i campioni in singoli microtubi da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Quindi, posizionare il mouse nella posizione prona e bagnare la pelliccia con il 70% di etanolo.
Per esporre la colonna vertebrale, fare una piccola incisione nella regione del bacino e rimuovere la pelle dagli arti posteriori verso la testa. Per rimuovere gli arti anteriori e posteriori, utilizzare le forbici per tagliare parallelamente e vicino alla colonna vertebrale su entrambi i lati. E rimuovere la testa alla base del cranio.
Usa le forbici per aprire il cranio dal forame magnum all'osso frontale. E usa le forcep per aprire il cranio in direzione laterale. Quindi usa le forcep per raccogliere delicatamente il cervello e posizionare il cervello in un microtubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio.
Usa forbici curve per pulire la colonna vertebrale di muscoli, grassi e tessuti molli e rimuovere la coda. Quindi posizionare la colonna vertebrale intatta in un tubo da 15 millilitri di PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio per non più di tre ore. Dopo la dissezione, trasferire il midollo spinale in un piatto di coltura tissutale per consentire la rimozione di tutti i tessuti molli rimanenti.
Usa una lama di rasoio per effettuare tre tagli trasversali attraverso la colonna vertebrale alle vertebre S2, L1 e T1. Trasferire i pezzi in singoli piatti da 15 millimetri contenenti PBS sterile ghiacciato. Tenere traccia e contrassegnare le origini dei segmenti per un'analisi successiva.
Successivamente, utilizzare le forcep per fissare un lato dorsale di segmento verso l'alto e utilizzare una lama di rasoio per fare un singolo taglio longitudinale attraverso la linea mediana per dividere la colonna in due metà uguali. Posizionare entrambe le metà in una nuova piastra di Petri contenente PBS fresco e sterile ghiacciato nell'orientamento originale per poter distinguere i lati sinistro e destro della colonna vertebrale. Al microscopio sezionato, utilizzare forcep fini per sbucciare delicatamente il midollo spinale da ogni metà della colonna vertebrale in direzione rostrale a caudale.
Quindi posizionare entrambe le metà del midollo spinale in singoli microtubi da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio. Per esporre il ganglio della radice dorsale, rimuovere delicatamente le meningi da un lato della colonna vertebrale all'altro. E estrarre il nervo spinale bianco esposto dalla colonna vertebrale.
Raccogli il ganglio rotondo e trasparente della radice dorsale dal segmento della colonna vertebrale in una piastra di Petri di 15 millimetri di PBS ghiacciato. E raccogliere il ganglio della radice dorsale ipsilaterale e contralaterale come appena dimostrato. Dopo aver raccolto il nervo spinale e il ganglio della radice dorsale dagli altri due segmenti della colonna vertebrale come appena dimostrato, centrifuga tutti i tubi di tessuto ad alta velocità.
Quindi aspirare i supernatanti e congelare flash i campioni in azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'omogeneizzazione. Per l'omogeneizzazione dei tessuti, scongelare i tubi di tessuto congelato sul ghiaccio prima di pesare 100 milligrammi di ciascun campione. Trasferire in un tubo di microcentrifugo a due millilitri contenente perline sterili e 500 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione.
Successivamente, interrompere i tessuti a temperatura ambiente su un omogeneizzatore a 20 cicli al secondo per due minuti, seguito da un periodo di attesa di un minuto e 20 cicli al secondo per altri due minuti. Dopo il secondo ciclo di omogeneizzazione, centrifugare i tessuti ad alta velocità prima di trasferire 500 microlitri di ogni supernatante in un nuovo tubo opportunamente etichettato. Conservare a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi downstream.
Il sito di abrasione è visibile nel footpad di controllo. Ed è tipico che una crosta si fori nel sito di abrasione come parte del processo di guarigione. Al contrario, i topi inoculati con pseudorabie, dimostrano una grave infiammazione del footpad all'endpoint umano che è caratterizzata da gonfiore e arrossamento.
L'esame istopatologico del pedone inoculato e del ganglio della radice dorsale rivela necrosi epidermica e grave infiammazione dermica all'interno delle sezioni del piede infettate da pseudorabi. L'infiltrazione di neutrofili è osservata anche nelle sezioni DRG infettate da pseudorabie. Un aumento significativo dell'espressione proteica G-CSF viene misurato nel footpad e nel ganglio della radice dorsale di topi infetti da pseudorabi rispetto ai controlli a sette e 82 ore dopo l'infezione.
Significativi livelli di G-CSF sono osservati anche a 82 ore dopo l'infezione nel midollo spinale, nel cervello, nel cuore e nei tessuti epatici di topi infetti da pseudorabie rispetto ai controlli. Inoltre, livelli significativi di IL-6 sono rilevati in tutti i tessuti testati di pseudorabie topi infetti a partire da 24 ore dopo l'infezione. In uno stato moribondo, sono state rilevate pseudorabie nel pedante, nel ganglio della radice dorsale, nel midollo spinale e nel cervello.
Con l'alta espressione citoplasmatica della psuedorabies glicoproteina gB nei neuroni del ganglio della radice dorsale nei topi infetti da pseudorabie. Per garantire un'infezione di successo, è importante che la goccia di virus in una colonna non cada dal footpad abraso. Questo modello animale può servire piattaforma per testare l'efficacia dei farmaci antinfiammatori e antivirali al fine di prevenire le neuropatie periferiche indotte dal virus.
