Bu protokol, araştırmacıların hayatta kalma larını tek hücrebazında izlemelerine ve hücre ölümünü veya hayatta kalmayı önemli ölçüde öngören değişkenleri belirlemelerine olanak tanır. Konvansiyonel sitotoksisite tahlilleri hücre popülasyonlarını değerlendirmek ve bireysel hücreleri ayırt etme yeteneği eksikliği. Boylamsal mikroskopi, popülasyondaki her hücre için ölüm zamanının atanmasını sağlar.
Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklar ve diğer durumlar için yeni tedavilerin değerlendirilmesi için uygundur. Bu yöntem nörodejeneratif koşullarda hastalık mekanizmaları keşfetmek için paha biçilmez kanıtlanmıştır, ve hücre ölümü ilgi olduğu diğer bozukluklara karşı eşit etkinlik ile uygulanabilir. Araştırmacılar gereksiz toksisite olmadan yeterli transfeksiyon verimliliği elde ile mücadele edebilir.
Çok kanallı pipet ile pratik ve protokol aşinalık zaman içinde bu zorluk azalmalıdır. Mikroskopi doğal olarak görsel bir metodolojidir. Bu nedenle, tekniği okuma nın yanı sıra izleyerek daha kolay anlaşılabilir.
Başlamak için, bir tüpte uygun miktarda azaltılmış serum media ve transfeksiyon reaktifini ve serum media ve DNA'yı ayrı bir tüpte birleştirin. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında hem tüpler ve kuluçka içeriğini birleştirin.
Kortikal nöronları her kuyuda 100 mikrolitre nöral bazal ortamla iki kez yıkamak için çok kanallı pipet ve steril plastik çukurlar kullanın. Ve şartlı medya ve diğer kalan ortamları 37 santigrat derecede saklayın. NBM'yi her kuyuda önceden hazırlanmış 100 mikrolitre NBKY çözeltisi ile değiştirin.
20 dakika sonra, transfeksiyon reaktifi ve DNA karışımı nın 50 mikrolitrepipet her kuyuya damlacık. Hücreleri 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri NBKY çözeltisi ile iki kez durulayın.
Daha sonra kuyulara 100 mikrolitre klimalı ortam ve 100 mikrolitre NBC çözeltisi ekleyin. Hücreleri görüntülemeye başlamak için, 96 kuyu plakasını floresan mikroskoba yerleştirin. Gelecekteki hizalama için bir başvuru olarak her plakaya özgü bir güven işareti kullanın ve bir görüntüyü gelecekteki başvuruiçin kaydedin.
Ardından, ilgi alanlarına gidin ve işarete göre x ve y koordinatlarını kaydedin. Gelecekteki hizalama için bir başvuru olarak her plakaya özgü bir güven işareti kullanın ve bir görüntüyü gelecekteki başvuruiçin kaydedin. Son olarak, floresan etiketi ifade transfected hücreleri odaklanmak.
Uygun floresan kanallarda düzenli aralıklarla birden fazla görüntü alın. Görüntü işleme ile başlamak için, Fiji simgesine çift tıklayın. Ardından, Fiji içindeki makroyu açmak için görüntünün alt çiziş makrosunu Fiji çubuğuna sürükleyin.
Görüntünün iki ila yedi satırLarını metin protokolüne göre işleme makrosunu alt üst edin. Sonra, dikiş tıklayın ve sonra ızgara / toplama dikiş. Doğru dikişli bir görüntü üretilene kadar açılır menüler, tür ve sipariş teki ayarları ayarlayın.
Bu seçimlere göre sekiz ve dokuzuncu satırlarda ızgara türü ve dikiş sırası değişkenlerini ayarlayın. Ardından, kuyu başına görüntü sayısını belirtmek için satır 10'u ayarlayın ve gerekirse arka plan çıkarma seçeneğini satır 14'e doğru ayarlayın. Yuvarlanan top yarıçapını metin protokolüne göre ayarlamak için satır 15'i ayarlayın ve Çalıştır'ı tıklatın.
Son olarak, çıktı görüntü yığınlarını açın ve metin protokolüne göre ölü nöronları el ile tanımlayın. Verileri elektronik tablo dosyasına kaydedin. İstatistiksel analiz yapmak için, hayatta kalmak için simgeye çift tıklayın.
R komut dosyası. İkinci satırı vurgulayın ve hayatta kalma kitaplığını yüklemek için çalıştır düğmesini tıklatın. Ardından, giriş elektronik tablosunu aramak için beşinci satırdaki yolu değiştirin ve çalıştır düğmesini tıklatın.
Sekiz ve dokuz daki satırları vurgulayın ve Cox orantılı tehlike çözümlemesi gerçekleştirmek için çalıştır düğmesini tıklatın. 12-16 ve 19-24 arası satırları vurgulayın. Kümülatif ölüm riskini ve hayatta kalma verilerini Kaplan-Meier eğrisi olarak çizmek için çalıştır düğmesini tıklatın.
Bu çalışmada, sıçan kortikal nöronlar floresan protein M elma kodlama bir plazmid ile dört gün sonrası kaplama transfected edildi. Transfeksiyon sonrası 24 saat, nöronlar floresan mikroskopi ile 10 gün üst üste her 24 saatte bir görüntülendi. Görüntü edinimi nin ardından görüntüler işlendi ve hücre ölümünü işaretlemek için sırayla incelendi.
Her hücre için ölüm zamanı floresan, morfoloji ve hücre gövdesinin parçalanması değişiklikleri ile belirlendi. Mutant nöronların sağkalım verileri üzerinde yapılan cox orantılı tehlike analizi 2.2 tehlike oranı ile sonuçlandı. Bu sonuç, vahşi tip popülasyona kıyasla mutant nöronlarda daha hızlı bir ölüm oranı gösterdi.
Bu yordamı çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, dikkatli bir şekilde borulamaktır. Hava maruziyetini en aza indirmek ve kabarcıklardan kaçınmak başarılı bir transfeksiyon için çok önemlidir. Transfeksiyondan sonra, uzunlamasına floresan mikroskobu hücre sağkalım ek olarak, protein lokalizasyonu, ciro ve ifade düzeyi de dahil olmak üzere hücre ölümüne katkıda bulunabilir çeşitli faktörlerin izlenmesi için kullanılabilir.
Nöro dejenerasyon alanında, uzunlamasına mikroskopinin dinamik doğası, hastalıkla ilişkili proteinlerin toplanmasının toksik veya koruyucu bir olayı temsil edip etmediğine ışık tutmuştur. Bu reaktiflerin veya aletlerin hiçbiri tehlikeli değildir.
