Bu protokol, sigara dumanının akciğer epitel hücrelerindeki psödomonas bakteri yükünü etkip etkilemeyeyiş olup olmadığını belirlemek için üç yaklaşım kullansın. Bu yöntem endotel hücreleri veya diğer hücre musluklar genişletilebilir. Sigara dumanı ekstraksiyonu, bakteriyel enfeksiyon ve bakteriyel yük ile belirlenmesi hazırlanması da bu videoda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Bu yordamı yeni kullanıcılar için takip etmek çok kolaydır. 60 mililitrelik şırıngaiçine 10 mililitre serumsuz hücre kültürü ortamı çizin. Bir kırpma dar ucunu şırınganın nozülüne bir mililitrelik pipet ucuna, sigarayı tutmak için bir adaptör olarak takın.
Filtreyi sigaradan çıkarın ve sigarayı adaptöre takın. Tayı yapmadan en fazla 30 dakika önce sigarayı yayın ve şırınganın içine hava içeren 40 mililitre duman çekin. Şırıngayı şiddetle sallayarak dumanı orta ile karıştırın.
Yaklaşık yedi dakika içinde yaklaşık 11 beraberlik gerektiren sigara tamamen tükenene kadar çizim işlemini tekrarlayın. Mikroorganizmaları ve çözünmez parçacıkları ortamdan çıkarmak için 0,22 mikron filtreden geçirin. Daha sonra, kapalı bir steril tüp orta aktarın.
Seçilmiş bir pseudomonas zorlanma ile bir triptik soya suyu veya TSB burgu plaka aşılamak. Tabağı bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Karbon kaynağı olarak% 5 gliserol ile TSB 20 mililitre içeren bir tüp hazırlayın.
Burgu plakasından bir yayma toplayın ve TSB'yi aşılayın. Pseudomonas süspansiyonuna 200 RPM'de 37 derece lik bir çalkalayıcı, yaklaşık bir saat boyunca, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.6 olana kadar inkübün. El yazmasında açıklandığı gibi akciğer epitel hücrelerini biraraya geldikten sonra hücrelere bir mililitre 0.25 tripsin ekleyin.
Yaklaşık beş dakika sonra, hücreler plakanın altından tamamen ayrıldığında, tripsini nötralize etmek için 10 mililitre tam Yükseklik ortamı ekleyin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede beş dakika ve 300 kez G.'yi çıkar ve süpernatant'ı atın.
Daha sonra, %10 FBS ile Heights ortamının mililitrelerine hücreleri yeniden askıya alın. Pipet 10 mikrolitre epitel hücre süspansiyonu yeni bir plaka üzerine. Hücre konsantrasyonu elde etmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın.
Plaka akciğer epitel hücreleri üç kez 10 mililitre başına beşinci hücrelere bir konsantrasyon, iyi başına orta iki mililitre toplam hacmi. Tabakları bir gecede kuluçkaya yatırın. Hücreler yaklaşık %80 biraraya geldiğinde, orta ortamı Heights ortamı ve %1 FBS ile değiştirin.
Daha sonra, kuyulara %4 CSE ekleyin ve plakaları üç saat kuluçkaya yatırın. CSE-tedavi akciğer epitel hücrelerinin her kuyuya bir pseudomonas ekleyin. Sonra, plakaları %5 karbondioksitle 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, altı kuyu plakasındaki ortayı iki mililitre taze Heights ortamı ile değiştirin, %4 CSE ve mililitre başına 100 mikrogram gentamisin içeren. Plakaları 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle bir saat kuluçkaya yattıktan sonra, kuyulardan ortayı aspire edin. İki mililitre soğuk PBS ile gentamisin ile tedavi edilen hücreleri iki kez yıkayın.
Akciğer epitel hücrelerindeki bakteri yükü daha sonra damla plaka yöntemi, qRT-PCR veya akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Akciğer epitel hücrelerinin her bir kuyuya bir mililitre hücre lisis tamponu ekleyin. Hücre lisatının seri seyreltmelerini 1'den 1'e 10'a, 10'a, 000'e kadar onarın.
Sonra TSB burgu plaka aşılayın. 16 saatlik kuluçkadan sonra, bakteri kolonilerinin sayısını da sayarak akciğer epitel hücrelerinde kaç koloni oluşturan ünite bulunduğunu belirleyin. Akciğer epitel hücrelerinin her bir kuyusuna guanidinium tiyokerit lysis tampon 0.35 mililitre ekleyin.
Bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak. Pipet bir mikro-santrifüj tüp içine lysate ve pipet ile yavaşça karıştırın. Lysate için taze hazırlanmış 0,35 mililitre ilave edin % 70 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.
Tüm örnekleri iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktarın. Toplama tüpünü 10, 000 kez G ve 20 ila 25 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin. Tamponu toplama tüpüne atın ve sütunu 0,7 mililitre yıkama tamponuyla yıkayın.
30 saniye boyunca 10, 000 kez G sütun santrifüj. Sütunu 0,5 mililitre arabellekle iki kez yıkayın. Santrifüju 10,000 kez G'de iki dakika boyunca tekrarlayın.
Sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin ve 30 ila 50 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. Tüpü 10,000 kez G'de bir dakika santrifüj ettikten sonra, akışı toplayın ve RNA konsantrasyonu ölçün. 20 mikrolitrelik ters transkripsiyon reaksiyonuna hazırlanmak için toplam RNA'nın bir mikrogramını 10 mikrolitre reaksiyon tamponu, bir mikrolitre ters transkriptaz ve RNase içermeyen su yapar.
Üreticinin protokolüne göre, ters transkripsiyon reaksiyonu bir saat boyunca 37 derecede, sonra 95 santigrat derecede beş dakika boyunca uygulayın. Daha sonra her cDNA örneğinin bir mikrolitresini, siber boya içeren ana karışımın beş mikrolitresi ve her 200 nanomolar özgüamı içeren bir mikrolitre ile karıştırın. 20 mikrolitre toplam hacmi için su ekleyin.
Üreticinin önerilerine göre PCR analizini gerçekleştirin. Ve sonra ifadeyi belirlemek için karşılaştırmalı CT yöntemini kullanın. BEAS-2B hücrelerinde, hücreler üç saat boyunca %4 CSE ile tedavi edildiğinde canlılık önemli ölçüde değişmedi.
Pseudomonas enfeksiyonu olarak bir saat de önemli ölçüde canlılık etkilemedi. Son olarak, kültür ortamında pseudomonas öldürmek için gentamisin kullanımı hücre canlılığı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi yoktu. Damla plaka yöntemi ile ölçüldüğü gibi, BEAS-2B hücrelerinde bakteriyel enfeksiyon CSE ile tedavi ile önemli ölçüde artmıştır.
Aynı HSAEC CSE tedavisi için de geçerliydi. CSE ile tedavi edilen BEAS-2B hücrelerinin bakteriyel enfeksiyonu da RT-PCR kullanılarak 16S rRNA mevcut miktarını ölçerek değerlendirildi, hangi Pseudomonas aeruginosa bir artış gösterdi. CSE ile tedavi edilen ve Pseudomonas floresan Migula ile enfekte olan BEAS-2B hücreleri 509 nanometrede akış sitometrisi ile analiz edildi.
Sonuç aynı zamanda CSE tedavisinin bakteriyel enfeksiyonu artırdığını göstermiştir. Floresan mikroskopi sonuçları, Pseudomonas floresan Migula enfeksiyon deneyinde GFP etiketli bakterilerin BEAS-2B hücreleri ile birlikte lokalize olduğunu göstermiştir. Hücreler, insan davranışlarını taklit edebilir ve doğrudan akciğer epitel hücreleri üzerinde sigara dumanı etkilerini incelemek mümkün hale robotlar sigara ile sigara dumanı maruz kalabilir.
Bu teknik bir pulmoner enfeksiyon bağlamında diğer hücre musluklar üzerinde bir sigara dumanı keşfetmek için kullanılabilir. Açıklanan yaklaşım, sigara içen sırt akciğer hasarı ve C0PD ekstrakarşı etkili tedavilerin gelişimsel temeli olarak tanımlanmıştır
