Knenotransplantasyon tedavi etmek için uygun bir yöntemdir Ancak, knenotransplantasyonun immün reddinin etkin bir şekilde izlenmesi hekimler ve araştırmacılar için bir sorundur. Bu protokol, ksenotransmümütasyonun immün reddini izlemek için basit, kullanışlı, düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntemdir. Bu teknik, domuzdan insana adacık nakli, böbrek nakli, karaciğer nakli ve kalp nakli gibi ksenotransplantasyon alanında kullanılabilir.
500 mikrolitre kan örneğini farklı mikro santrifüj tüplerine aktararak başlayın. Tüplere 20 mikrolitre proteaz K ve 500 mikrolitre lysis tampon ekleyin. Sonra iyice karıştırmak için sallayın.
Tüpleri 10 dakika boyunca 56 derecede bir su banyosuna koyun, kuluçka sırasında 2-3 kez sallayın, çözelti temizlenene kadar tüp kapaklarının iç duvarındaki sıvı boncukları çıkarmak için kısa bir süre için onları santrifüj edin. Sonra Susuz, Etil Alkol 500 mikrolitre ekleyin ve iyice sallayın. Karışımı adsorpsiyon sütununa aktarın.
Sonra iki dakika boyunca sütun santrifüj ve atık sıvı atın. Her adsorpsiyon sütununa 800 mikrolitre durulama çözeltisi ekleyin ve bir dakika lığına santrifüj ekleyin. kalan durulama çözeltisini kurutmak için kolonları oda sıcaklığında birkaç dakika bekletin.
Emilim kolonlarını temiz bir santrifüj tüpe aktarın. Adsorpsiyon filmlerinin ortasına 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve 2-5 dakika oda sıcaklığında yerleştirin, sonra bir dakika santrifüj. PcR ana karışımı nı el yazması yönlere göre hazırlayın, ardından her 0,6 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 23 mikrolitre karışımı ekleyin.
Her tüp ve dikkatle Cabot genomik DNA iki mikrolitre ekleyin. Sonra kısaca karıştırın ve santrifüj. Tüpleri bir PCR döngüsüne yerleştirin ve amplifikasyona başlayın.
Reaksiyon bittiğinde Agarose elektroforezgerçekleştirin. Tae yüz milimetre içeren bir şişe içine Agarose 1,2 gram ekleyin ve mikrodalga beş dakika kaynatın. Agarose yaklaşık 70 santigrat dereceye kadar soğuduktan sonra, şişeye beş mikrolitre nükleik asit boyası ekleyin, yavaşça, tabağa dökün ve bir jel haline gelene kadar oda sıcaklığında bırakın.
Bantlar ayrılana kadar 120 milyon iskelede Agarose jel ve elektroforez kuyularına her numuneden beş mikrolitre ve 2 Günlük DNA Merdiveni veya DNA Marker 1 ekleyin. Jeli ultraviyole bir görüntüleyiciyle görselleştirin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi dönüşümü gerçekleştirdikten sonra, ecor I ve Bam HI ile çift restriksiyon enzim sindirim iline plazmidleri doğrulayın. Sindirilmiş ürünleri %1 Agarose elektroforezile ayırın ve jeli UV ışığına maruz bırakın.
İki kez 10 için başlangıç standart çözüm için mililitre başına 11 kopya domuz DNA parçası ile konsantre plazmid seyreltin, Çift distile su kullanarak. Standart bir eğri oluşturmak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi bir qPCR ana karışımı hazırlayın ve sekiz tüplü bir şeridin her tüpüne karışımın 40 mikrolitresini ekleyin. Farklı konsantrasyonlarda standart DNA 10 mikrolitre ekleyin, tüpler kapağı sonra kısa bir süre karıştırın ve onları santrifüj.
Tüpleri qPCR makinesine yerleştirin ve amplifikasyon gerçekleştirin. Domuzdan maymuna arter yama modellerinden yaklaşık 400 mikrolitre veya domuzdan fareye hücre nakli modellerinden 100 mikrolitre kan örneği toplamak için EDTA tüpleri kullanın. Daha sonra örnekleri 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın.
Düşük sıcaklık ve yüksek hızda santrifüj ile kan örneklerinden kan hücrelerini çıkarın. Supernatant'ı 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre enkazını 16,000 kez G'de 10 dakika santrifüj le çıkarın. Süpernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve DNA çıkarma kitini dolaşırken ticari bir serum kullanarak dolaşan DNA'yı ayıklayın.
Sirkülasyondaki DNA hacmini 40 mikrolitreye kadar yoğunlaştırın ve negatif 20 santigrat derecede saklayın. Dolaşan domuza özgü DNA'yı ölçmek için qPCR yapın. Domuza özgü astarlar qPCR ile dolaşan domuza özgü DNA'yı ölçmek için, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yamalarında, transplantasyon modellerinde tasarlanmış ve kullanılmıştır.
Agarose elektroforezi güçlendirilmiş DNA parçalarını izole etmek için kullanıldı. PCR kullanılarak, güçlendirilmiş domuz genomik DNA'sı için astarlar spesifik olarak tanımlandı. Daha sonra, maymun veya insan genomik DNA kohort veya fare genomik DNA kohort bu astarların türlerin özellikleri doğrulandı.
Son olarak iki türe özgü astarlar, domuz-to-maymun arter yama domuz DNA yükseltmek için kullanılan ve fare domuz, hücre nakli modelleri. Bu protokol çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, her türlü kontaminasyonun engellenmesi gerektiğidir. Bu teknik, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için basit bir düşük maliyetli ve non invaziv bir yöntem olduğu için araştırmacıların ksenotransplantasyon içinde yeni sorular keşfetmelerinin önünü açtır.
