Cuantificación del ADN específico de la porcino circulante en la sangre de un modelo de trasplante

El xenotrasplante es un método factible para tratar Sin embargo, el monitoreo eficaz del rechazo inmune del xenotrasplante es un problema para los médicos y los investigadores. Este protocolo es un método simple, conveniente, de bajo costo y menos invasivo para monitorear el rechazo inmune de la xenotransmutación. Esta técnica se puede utilizar en el campo del xenotrasplante, incluyendo el trasplante de islote de cerdo a humano, trasplante de riñón, trasplante de hígado y trasplante de corazón.

Comience por transferir 500 microlitros de muestras de sangre a diferentes tubos de micro centrífuga. Añadir 20 microlitros de proteasa K y 500 microlitros de tampón de lelisis en los tubos. A continuación, agítelos a fondo para mezclar.

Poner los tubos en un baño de agua a 56 grados Celsius durante 10 minutos, sacudiéndolos de dos a tres veces durante la incubación hasta que la solución se convierte en centrifugarlos claramente para eliminar las perlas líquidas de la pared interna de las cubiertas del tubo. A continuación, agregue 500 microlitros de alcohol anhidro, alcohol etílico, y agitar bien. Transfiera la mezcla a la columna de adsorción.

A continuación, centrifugar la columna durante dos minutos y deseche el líquido de desecho. Agregue 800 microlitros de solución de enjuague a cada columna de adsorción y centrifugar durante un minuto. dejar las columnas a temperatura ambiente durante unos minutos para secar la solución de enjuague restante.

Transfiera las columnas de absorción a un tubo centrífugo limpio. Agregue 50 microlitros de tampón de elución a la mitad de las películas de adsorción y colóquelos a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, luego centrifugarlas durante un minuto. Prepare la mezcla maestra de PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego agregue 23 microlitros de la mezcla en cada tubo de micro centrífuga de 0,6 mililitros.

Añadir dos microlitros de ADN genómico a cada tubo y cuidadosamente Cabot. A continuación, mezcle brevemente y centrifugar. Coloque los tubos en un ciclor pcR e inicie la amplificación.

Cuando la reacción haya terminado, realice la electroforesis de Agarrose. Añadir 1,2 gramos de Agarrose en un matraz que contenga cien milímetros de TAE y hervirlo durante cinco minutos en el microondas. Una vez que la Agaria se haya enfriado a aproximadamente 70 grados Celsius, añadir cinco microlitros de tinte de ácido nucleico en el matraz, lentamente, verter en la placa y dejarlo a temperatura ambiente hasta que se solidifique en un gel.

Añadir cinco microlitros de cada muestra y Escalera de ADN de 2 registros o Marcador de ADN 1, en los pozos del gel de Agarosa y electroforesis en 120 millones de muelles hasta que las bandas estén separadas. Visualice el gel con un imágenes ultravioletas. Después de realizar la transformación como se describe en el manuscrito de texto, verifique los plásmidos por digestión enzimática de doble restricción con EcoR I y Bam HI. Separe los productos digeridos con electroforesis de 1%agarosa y exponga el gel a la luz UV.

Diluir el plásmido concentrado con el fragmento de ADN porcino a dos veces 10 a la 11a copias por mililitro para la solución estándar de partida, Utilizando agua destilada doble. Para establecer una curva estándar, prepare una mezcla maestra qPCR, como se describe en el manuscrito de texto, y agregue 40 microlitros de la mezcla en cada tubo de una tira de ocho tubos. Añadir 10 microlitros de ADN estándar de diferentes concentraciones, tapar los tubos y luego mezclar brevemente y centrifugarlos.

Coloque los tubos en la máquina qPCR y realice la amplificación. Utilice tubos EDTA para recoger muestras de sangre de aproximadamente 400 microlitros de los modelos de parches de arteria de cerdo a mono, o 100 microlitros de los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón. A continuación, transfiera las muestras a tubos centrífugos de 1,5 mililitros.

Retire las células sanguíneas de las muestras de sangre por centrifugación a baja temperatura y alta velocidad. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y retire los desechos celulares por centrifugación a 16.000 veces G durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y extraiga el ADN circulante utilizando un suero comercial mientras circula el kit de extracción de ADN.

Condensa el volumen de ADN circulante a 40 microlitros y guárdalo en 20 grados Celsius negativos. Realice qPCR para cuantificar el ADN específico del cerdo circulante. Las imprimaciones específicas de porcino fueron diseñadas y utilizadas para cuantificar el ADN específico de cerdo circulante por qPCR, en modelos de trasplante de células de cerdo a ratón y parche de arteria de cerdo a mono, modelos de trasplante.

La electroforesis de agarosa se utilizó para aislar fragmentos de ADN amplificados. Utilizando PCR, se identificaron las imprimaciones específicas para el ADN genómico porcino amplificado. A continuación, se confirmaron las especificidades de las especies de estas imprimaciones en la cohorte de ADN genómico humano o mono o en la cohorte de ADN genómico de ratón.

Finalmente se utilizaron dos imprimaciones específicas de especies, para amplificar el ADN de cerdo en el parche de la arteria de cerdo a mono y los modelos de trasplante de células de cerdo a ratón. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo, es que se debe prevenir la contaminación de todo tipo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas dentro del xenotrasplante porque es un método simple de bajo costo y no invasivo para monitorear el rechazo inmune del xenotrasplante.