异种移植模型中循环猪特异性DNA的定量

异种移植是治疗的可行方法，然而，有效监测异种移植的免疫排斥是医生和研究人员面临的一个问题。该协议是一种简单、方便、成本低、侵入性较小的方法来监测异种转化的免疫排斥。该技术可用于异种移植领域，包括猪对人岛移植、肾移植、肝移植和心脏移植。

首先将500微升血液样本转移到不同的微离心管中。在管中加入20微升蛋白酶K和500微升的解液缓冲液。然后彻底摇动它们混合。

将管子在56摄氏度的水浴中放入10分钟，在孵育过程中摇动两到三次，直到溶液变得清晰，将它们短暂离心，从管盖内壁上取出液体珠子。然后加入500微升无水、乙基醇，彻底摇动。将混合物转移到吸附列中。

然后将柱子离心两分钟，丢弃废液。在每个吸附柱中加入800微升冲洗溶液，并离心机一分钟。将柱在室温下保持几分钟，以干燥剩余的冲洗溶液。

将吸收柱转移到干净的离心管中。在吸附膜中间加入50微升洗脱缓冲液，将其放在室温下两至五分钟，然后离心1分钟。根据手稿方向准备 PCR 主混合，然后将混合的 23 微升添加到每个 0.6 毫升微离心管中。

在每个管中加入两个微升的基因组DNA，并小心地卡博特。然后短暂混合和离心。将管子放在 PCR 循环器中，然后开始放大。

当反应完成后，执行阿加糖电泳。将1.2克阿加糖加入含有100毫米TA的烧瓶中，在微波炉中煮5分钟。一旦阿加罗斯冷却到约70摄氏度，将5微升的核酸染料加入烧瓶中，慢慢倒入盘子中，在室温下保持，直到凝固成凝胶。

在每个样品中加入5微升和2-LogDNA梯子或DNA标记1，加入1.2亿个码头的阿加罗斯凝胶和电泳井，直到带子分离。使用紫外线成像器可视化凝胶。执行文本手稿中描述的转换后，使用 EcoR I 和 Bam HI 通过双限制性酶消化验证质粒。将消化的产品与1%的阿加糖电泳分离，将凝胶暴露在紫外线下。

使用双蒸馏水，用猪DNA片段稀释浓缩质粒，每毫升2倍10至11份。要建立标准曲线，请准备一个 qPCR 主混合，如文本手稿中所述，并将混合的 40 微升添加到八管条的每个管中。加入10微升不同浓度的标准DNA，盖住管子，然后短暂混合和离心。

将管子放在 qPCR 机器中并执行放大。使用 EDTA 管从猪到猴子动脉贴片模型收集大约 400 微升的血液样本，或从猪到老鼠细胞移植模型中收集大约 100 微升的血液样本。然后将样品转移到1.5毫升离心管。

在低温和高速下离心，从血液样本中去除血细胞。将上经剂转移到新的1.5毫升离心管中，并在16，000次G下离心，在10分钟内清除细胞碎片。将上流液转移到新的1.5毫升离心管中，在循环DNA提取试剂盒时，使用商业血清提取循环DNA。

将循环DNA的体积压缩到40微升，并将其储存在负20摄氏度。执行 qPCR 以量化循环猪特异性 DNA。猪特异性底像被设计并用于通过qPCR，在猪对老鼠细胞移植模型和猪到猴子动脉补丁，移植模型中量化循环猪特异性DNA。

阿加罗斯电泳用于分离放大的DNA片段。使用PCR，鉴定了放大猪基因组DNA的底剂特异性。其次，这些遗传基因在猴子或人类基因组DNA队列或小鼠基因组DNA队列中的物种特异性得到确认。

最后两个物种特异性底法，用于放大猪DNA在猪到猴子动脉补丁和猪到小鼠，细胞移植模型。在尝试此协议时，要记住的最重要的事情是，应防止各种污染。这项技术为研究人员探索异种移植中的新方法铺平了道路，因为它是一种简单的低成本和非侵入性方法来监测异种移植的免疫排斥。