Yazarlar, Michael Solga'ya ve Flow Cytometry Core personelinin geri kalanına akış sitometrisi eğitimi ve hizmetleri sağladıkları için teşekkür etmek ister. Yazarlar ayrıca Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye ve Prasad Srikakupu'ya lipozom hazırlama (SSKD, DKB), doku hasadı (MAM, JCG) ve akış sitometri boyama ve numune edinme (AU, PS, CM) konusundaki yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 ve R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 ve T32 HL007284 hibeleri ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+from+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).</li><li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR&#945;/&#947;+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects.">In vivo liposomal delivery of PPAR&#945;/&#947; dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li><li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects.">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li><li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+A+Fundamental+Process+in+Immunity.">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li><li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases.">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li><li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system:+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases.">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li><li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly(ethylene+glycol)-containing+liposomes.">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li><li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes:+A+review.">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li><li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging.">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).</li><li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation.">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice.">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li><li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance.">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li><li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice.">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li><li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues.">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li><li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines:+Recent+advances+and+future+prospective.">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li><li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment.">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li><li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Use+of+Tail+Vein+Metastasis+Assays+and+Real-Time+In+Vivo+Imaging+to+Quantify+Breast+Cancer+Metastatic+Colonization+and+Burden+in+the+Lungs.">Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).</li><li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li><li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis.">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li><li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jir&#243;n Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells.">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li><li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada (i) floresan lipid boyası ile etiketlenmiş ve bir anti-diyabetik bileşik olan tesaglitazar ile yüklenmiş lipozomlar hazırlamak, (ii) retro-orbital enjeksiyon yoluyla bir fareye lipozomlar uygulamak ve (iii) akış sitometrisi ile hücresel düzeyde lipozom alımını tespit etmek için dokuları toplamak, işlemek ve lekelemek için üç bölümlü bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, yaklaşık 150-μm lipozomların hazırlanmasını ve yağ, kan ve dalaktaki alımın değerlendirilmesini gözden geçirir. Lipozom preparatı ölçeklenebilir, çoğunlukla oda sıcaklığında gerçekleştirilir ve ilaç yüklemesini ve organik çözücülerin uzaklaştırılmasını en üst düzeye çıkarmak için ters faz buharlaştırmasını kullanır. Bu protokolü kullanarak, saflaştırılmış lipozom numunesinde 2 mg / mL'ye kadar tesaglitazar konsantrasyonu elde edilebilir. Hazırlanan lipozomlar HEPES tamponunda 4 °C'de bir yıldan fazla saklanabilir. Deneyimlerimize göre, ortalama parçacık boyutunun minimum varyasyonunu gösterdiler. İlaç içeriği kaybının% 10'undan azı, lipozomların 10 kDa santrifüj filtre ile harici ilaçtan ultrafiltrasyon ile ayrılmasını takiben spektrofotometrik olarak gösterilmiştir.
Lipozom hazırlığı sırasında, dikkate alınması gereken bazı kritik adımlar ve faktörler vardır. İlk olarak, protokol adımlarının sırası önemlidir ve bunlara uyulmalıdır. İkincisi, tesaglitazar yüklenirken kullanılan çözeltinin pH'ı, çözünürlüğü ve etkili yüklemeyi en üst düzeye çıkarmak için 7.4'te tutulmalıdır. Üçüncüsü, ekipman ve filtrelerin uygun şekilde monte edilmesi, her adımın çıktısının uygun boyutta ve saflıkta olmasını sağlar. Örneğin, 100 ve 200 nm filtreler düzgün bir şekilde monte edilmezse, daha heterojen ve uygun olmayan boyutta bir lipozom grubu ortaya çıkabilir. Dördüncüsü, ilaç yüklemesinden önce Ca-asetatın tamamen çıkarılması, tesaglitazarın lipozomlara transferini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Ca-asetatın tamamen çıkarılmasını test etmek için, lipozomları çıkarmak için yüksek hızlı çökeltme kullanın ve daha sonra lipozomal olmayan çözeltideki Ca-asetat seviyelerini ölçün. Beşinci olarak, her adımda lipozom preparatına eklenen tüm malzemelerin kütlesini tartmak ve kaydetmek önemlidir. Bu, uygun konsantrasyonların hesaplanabilmesini ve gerekli malzeme oranlarının korunmasını sağlar. Son olarak, teknik uygun şekilde uygulanmazsa, istenmeyen bir heterojenlik seviyesi olabilir. Bu parametreyi DLS ve elektron mikroskobu gibi diğer yaklaşımları kullanarak iyice kontrol etmek önemlidir. Homojenliği artırmak için, seçilen filtre boyutunu ayarlamayı veya iki filtreyi istiflemeyi düşünün.
Ek olarak, bu protokolü tam olarak yürütmeden önce kontrollerin ve akış sitometrisi için bir antikor panelinin planlanması ve optimize edilmesi kritik öneme sahiptir (Tablo 1, Tablo 3). Antikorlar, boyama için uygun konsantrasyonların kullanıldığından ve floroforlar arasındaki örtüşmenin minimum düzeyde olduğundan emin olmak için test edilmelidir. Lipozom hazırlama sırasında kullanılan boyanın uyarılması ve emisyonu da panel planlamasına dahil edilmelidir. Sonuçlarımızda, Allophycocyanin (APC) ve AlexaFluor 647 gibi floroforlara benzer bir uyarma ve emisyona sahip olan DiD'yi kullandık. Bu nedenle, antikor panelimizde bu floroforlara konjuge edilmiş antikorları seçmedik. Ayrıca, izotip kontrolleri bu protokole dahil değildir. Bunun nedeni, bu protokol için seçilen antikorların iyi doğrulanmış, ticari olarak temin edilebilen antikorlar olmasıdır. Bununla birlikte, daha önce optimize edilmemiş bir antikor kullanmakla ilgileniyorsanız, lütfen tam deneyi yapmadan önce antikoru ilgili dokular üzerinde izotip kontrolüne karşı test etmeyi düşünün.
Bu protokol, tedavi sonrası fareden kan, dalak, kasık yağ ve epididim yağ dokularının nasıl çıkarılacağını ve işleneceğini gösterirken, bu genel yaklaşım diğer dokulara da uygulanabilir. İlgilenilen dokuya bağlı olarak, işleme ve sindirim protokollerinin aşağıdaki dokular için yayınlandığı gibi değiştirilmesi gerekebilir: akciğer21, karaciğer22, periton boşluğu 3, kemik iliği3,23, beyin 24.
Bu yöntemin dikkate alınması gereken önemli bir sınırlaması, alımın hayvan başına yalnızca bir zaman noktasında değerlendirilebilmesidir. Bu nedenle, bu protokolü diğer non-invaziv görüntüleme teknikleriyle birleştirmek veya değerlendirmeyi yürütmek için yeterli kaynakları sağlamak için buna göre plan yapmak avantajlı olabilir. Hücresel alımın zamanlaması ve hücresel dönüşüm, dikkate alınması gereken önemli faktörlerdir: lipozomlar ilk 24 saat içinde vücutta dolaşır ve lipozomları alan hücrelerin ömrüne veya alıma nasıl tepki verdiklerine bağlı olarak, hücre ölümü veya daha fazla fagositoz oluşabilir. Önceki çalışmamız, DiD + popülasyonlarının popülasyon özelliklerinde farklı zaman noktalarındadeğişiklikler göstermiştir 3. Bu nedenle, daha erken zaman noktalarında veya ilgi mekanizmasının biyolojisi ile en alakalı zaman noktalarında alımı değerlendirmek önemlidir. Ek olarak, tüm dokudaki hücre alımının nicelleştirilmesi bu protokol ile yapılabilirken, akım sitometrisi doku lokalizasyonunu ortaya çıkaramaz. Bu yaklaşımın histolojik yöntemlerle birleştirilmesi bu sınırlamanın giderilmesine yardımcı olabilir.
Genel olarak, bu protokol histoloji ve tüm vücut floresan görüntüleme gibi mevcut metodolojiyi tamamlar. Akış sitometri araç ve yöntemlerindeki sürekli gelişmelerle, giderek daha spesifik hücre popülasyonlarına daha büyük panellerin geliştirilmesi mümkün olacaktır. Bu protokolün yukarıda belirtilen yöntemlere ek olarak kullanılmasını öneriyoruz, çünkü bu, hücresel alımın değerlendirilmesini iyileştirecek ve aynı zamanda akış sitometrisi ile gözlemlenen sonuçları doğrulama fırsatı sağlayacaktır. Örneğin, yağ dokusundaki parçacıkların çoğunluğunun makrofajlar tarafından akış sitometrisi ile alındığı tespit edilmelidir. Aynı yağ dokusunun ek bir alikotunun immünofloresansı, hücre tipinin gerçekten lipozomları aldığını doğrulamak için makrofaj belirteçleri için kaydedilebilir, sabitlenebilir, kesitlenebilir ve boyanabilir. Bu yaklaşım, yürütülen nanopartikül biyodağılım analizlerine titizlik katmalıdır: hücreye özgü hedeflemeyi doğrulamak, hücresel alımı ölçmek, hedef dışı alımı tanımlamak ve umarım gözlemlenen terapötik sonuçlar için mekanik hipotezler üretmek için bilgi sağlamak. Bu protokol aynı zamanda farklı lipozomlar kullanarak, diğer dokulardaki alımı araştırarak ve obezite ve dismetabolizma ortamında veya nanopartikül dağıtımının uygulanabilir bir terapötik seçenek olduğu başka herhangi bir hastalık ortamında yeni bileşikleri test ederek gelecekteki çalışmalar için uyarlanabilir.

Nanopartikül ilaç dağıtımını kullanan tedavilerin geliştirilmesine olan ilgi arttıkça, parçacık dağılımını ve alımını hazırlama ve değerlendirme yöntemleri ilerlemeye, genişlemeye ve araştırma topluluğu için erişilebilir olmaya devam etmelidir 1,2. Bu protokol, peroksizom proliferatör-aktive reseptör (PPAR)-α/γ agonisti 3,4 olan tesaglitazar yüklü DiD etiketli lipozomlarla yapılan bir tedaviyi takiben in vivo lipozomları alan kesin hücre tiplerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda, lipozomal tesaglitazar tedavisinden hangi hücre tiplerinin doğrudan etkilendiğini, moieties hedeflemenin etkinliğini değerlendirebildik ve gözlemlediğimiz tedavi sonuçlarını açıklamak için hipotezler üretebildik. Ayrıca, çeşitli hücre tiplerinde yerleşik biyolojik fonksiyonlar, makrofajlar, dendritik hücreler ve karaciğere özgü Kupffer hücreleri gibi fagositik hücrelerin lipozomların çoğunu aldığını göstermektedir 5,6,7. Bu protokolü kullanarak, klasik olmayan fagositlerin de lipozomları alabileceğini gösterdik 3,4.
Bu protokol, tesaglitazarın çözünmesi, ters faz buharlaşması ile lipozomların hazırlanması ve uzaktan ilaç yüklemesi için bir çekici olarak kalsiyum asetat kullanılması için optimize edilmiş bir yöntem sunar. Sunulan yöntemler birçok laboratuvar tarafından erişilebilir durumdadır ve elde edilmesi zor malzemelerden ve yüksek sıcaklıklar gerektiren adımlardan yoksundur. Protokol, in vivo8'in artan dolaşımı için en uygun olan boyutlarda lipozomlar üretir. Ayrıca, Su ve ark. tarafından özetlendiği gibi, bugüne kadar, in vivo lipozom dağılımını ve doku alımını değerlendirmek için yöntemler derinlemesine çalışılmış ve test edilmiştir9. Pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve floresan moleküler tomografi (FMT) yöntemleri dokuya özgü biyodağılımı ve alımı ölçmek içinuygulanmaktadır 9,10,11. Bu yöntemler in vivo tespiti en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş olsa da, hala hücresel çözünürlükte in vivo lipozom alımını ölçme yeteneğinden yoksundurlar. Burada sunulan protokol, akış sitometrisi kullanarak bu ihtiyacı karşılamayı amaçlamaktadır. Son olarak, bu protokol için, hücresel alım, yağ dokusu da dahil olmak üzere birkaç dokuya daraltıldı. Obezite, dismetabolizma ve inflamasyon ortamında tedaviler sunmak için nanopartiküllerin kullanım potansiyelini araştıran büyüyen bir literatür grubu vardır 12,13,14,15,16,17. Bu nedenle, bu patolojilerde önemli bir rol oynayan dokulardan biri olan yağ dokusunu işlemek ve analiz etmek için etkili yöntemlerle bir protokolü paylaşmanın önemli olduğunu hissettik.

<table><tbody><tr><td>1-mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Desalting spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp;amp; PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gauze sponges</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposome extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic lubricant</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Sterile</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene vial for mincing</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonate membranes</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

Özellikle hedefli tedavi yaklaşımları için bileşikleri in vivo olarak vermek için lipozomların kullanılmasına artan bir ilgi vardır. Lipozom formülasyonuna bağlı olarak, lipozomlar tercihen vücuttaki farklı hücre tipleri tarafından alınabilir. Bu, terapötik parçacığın etkinliğini etkileyebilir, çünkü farklı hastalıkların ilerlemesi doku ve hücre tipine özgüdür. Bu protokolde, DSPC, kolesterol ve PEG-2000 DSPE ve lipit boya DiD'yi floresan etiket olarak kullanarak lipozomları sentezlemek ve floresan olarak etiketlemek için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol aynı zamanda in vivo lipozomlar vermek ve akış sitometrisi kullanarak lipozomların hücreye özgü alımını değerlendirmek için bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yaklaşım, lipozomları alan hücre tiplerini belirlemek ve lipozom alımının hücre tipleri ve dokular arasındaki dağılımını ve oranını ölçmek için kullanılabilir. Bu protokolde belirtilmemiş olsa da, bir sitometre üzerinde immünofloresan ve tek hücreli floresan görüntüleme gibi ek testler, hücre içi boyamanın değerlendirilmesine izin verdikleri için yapılan bulguları veya sonuçları güçlendirecektir. Protokollerin, ilgilenilen doku (lar) a bağlı olarak da uyarlanması gerekebilir.

Lipozom Üretimi
Burada yayınlanan sonuçlar, daha önce yayınlanmış olan 3,4,20 çalışmamızdakilere benzer. Burada sunulan protokolü kullanarak, yaklaşık 150 \ u2012160 nm boyutunda lipozomlar üretmeyi bekliyoruz. DLS, ortalama lipozom çapının 163.2 nm ve zeta potansiyelinin -19.2 mV olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 1A). Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) görüntülemesi dairesel lipozomları ortaya çıkarır (Şekil 1B) ve DLS diyagramı ortalama çaptan nispeten küçük bir standart sapma ortaya çıkarır (Şekil 1C).
Pozitif lipozom bağlanması, PBS ile tedavi edilen bir kontrol gerektirir
Bu protokolü kullanan grubumuzdan yapılan önceki çalışmalar, in vivo uygulamadan bir hafta sonra lipozomlara bağlı yağ SVF, dalak ve kandaki hangi hücre alt kümelerinin araştırıldığını araştırmıştır 3,4. PBS ile tedavi edilmiş bir fare kullanılarak, periton boşluğu ve dalak hücreleri, lipozomla tedavi edilen farelerden alınan örneklerde kullanılan aynı antikor paneli ile boyandı. Dokular bir haftalık tedavilerden sonra hasat edildi (Şekil 2A). PBS ile muamele edilmiş fareden alınan örnekler, pozitif DiD kapıları oluşturmak için bir DiD FMO görevi gördü (Şekil 2B, C). DiD-pozitif sinyal kullanılarak pozitif bir kapı oluşturulabilir, ancak pozitif kapının herhangi bir DiD-negatif numune içermediğini doğrulamak için DiD sinyali olmayan örnekler de kullanılmalıdır.
Floresan sinyallerini optimize etmek için titrasyonlara ihtiyaç vardır
Tam bir deney yapmadan önce, hücre boyama sırasında kullanılan floresan konjuge antikorların konsantrasyonu ve lipozom hazırlama sırasında kullanılan lipit boyası dahil olmak üzere çeşitli koşullar optimize edilmelidir. Akış sitometreleri, floresan yoğunluğu için bir üst algılama sınırına sahiptir, bu nedenle lipozomlara dahil edilen çok fazla boya, sitometreden geçen numunelerde ölçülemeyen DiD sinyal seviyelerine yol açacaktır. Ayrıca, lipozomlardaki çok fazla DiD, hücresel alım sonuçlarını çarpıtabilecek yüksek düzeyde spesifik olmayan boya transferine yol açabilir. Şekil 3, kullanılan akış sitometresinin algılama aralığında optimal bir sinyal üretecek konsantrasyonu tanımlamak için lipit boya konsantrasyonlarının titre edildiği bir deneyden elde edilen sonuçları bildirmektedir. Bu, son deney için ilgilenilen dokular üzerinde gerçekleştirildi: Kan (Şekil 3A), inguinal yağ SVF (Şekil 3B) ve epididim adipoz SVF (Şekil 3C). Test için seçilen konsantrasyonlar, 1 mL lipozom başına 10 mg DiD (Yüksek, kırmızı), 1 mg DiD (Orta, mavi) veya 0.1 mg DiD (Düşük, gri) idi. Lipozomlarda kullanılan en yüksek konsantrasyon çok yüksekti ve her üç dokuda da sitometrenin ölçülebilir aralığını aştı (Şekil 3A \ u2012C, kırmızı). En düşük DiD konsantrasyonu bir miktar sinyal gösterdi (Şekil 3 A\u2012C, gri), ancak PBS ile tedavi edilen hücrelerin ötesinde net bir popülasyon gözlenmedi (Şekil 3A\u2012C, siyah). Ölçüldüğünde, her doku ve konsantrasyon için DiD MFI'nın aritmetik ortalaması, PBS kontrolleri ile DiD'nin orta konsantrasyonu arasında net bir ayrım olduğunu göstermiştir (Şekil 3D). Bu nedenle, protokolde belirtildiği gibi, lipozom preparatımızda kullanmak üzere orta konsantrasyonu (Şekil 3, mavi) seçtik.
Çoklu antikor panelinin kullanılması, lipozom alımının farklı hücre alt kümeleri tarafından tanımlanmasına izin verir
Tablo 3'te özetlenen panel kullanılarak, hücreler makrofajlar, B hücreleri, T hücreleri, dendritik hücreler, monositler ve endotel hücreleri için belirteçlere karşı antikorlarla boyandı (Şekil 4). Her doku tipi için biraz farklı geçit stratejileri gereklidir, ancak her birinde aynı hücre tiplerinin çoğu tanımlanabilir. Bazı istisnalar, normalde kanda bulunmayan endotel hücrelerini ve kanda tipik olarak diğer dokulardan daha yüksek sıklıkta bulunan monositleri içerir. Popülasyonlar tanımlandıktan sonra, her hücre popülasyonunun toplam büyüklüğü ve DiD + oldukları frekans ölçülebilir. DiD + popülasyonunu karakterize etmek için daha fazla hesaplama yapılabilir: DiD + hücrelerinin yüzde kaçının makrofajlar, endotel hücreleri vb. Lütfen unutmayın, bunlar örnek geçit stratejileridir, ancak örnekleri analiz etmenin tek yolu değildir. Analiz, seçilen panel ve mevcut akış sitometreleri tarafından belirlenecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Şekil 1: Hazırlanan lipozomların örnek özellikleri. (A) Boyut ve zeta potansiyeli yukarıda açıklandığı gibi ölçülmüş ve tablo şeklinde rapor edilmiştir. Her parametre ortalama ± standart sapma olarak sunulur. (B) Hazırlanan lipozomları görüntülemek için Cryo-EM kullanıldı. Beyaz ölçek çubuğunun uzunluğu 50 nm'dir. (C) DLS, bu hazırlıkta lipozomların çapının histogramını oluşturmak için kullanıldı. Bu rakam Osinski ve ark.3'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Şekil 2: PBS veya Lipozom ile tedavi edilen farelerden temsili DiD boyaması. (A) PBS ve lipozom tedavileri için deneysel şema. PBS veya lipozomlar bir hafta boyunca üç kez enjekte edildi. Dokular tedavinin 8. gününde hasat edildi. (B, C) Temsili akış grafikleri, lipozomla tedavi edilen (C) farelerde pozitif DiD boyamasını ortaya çıkarır, ancak PBS ile tedavi edilen (B) farelerde değildir. FSC, ileri saçılma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Şekil 3: Lipozomlarda DiD titrasyonu. Lipozomlar üç farklı DiD konsantrasyonu ile hazırlandı ve farelere enjekte edildi. Gri, 1 mL lipozom başına 0.1 mg DiD'deki düşük konsantrasyonu, mavi 1 mg DiD / mL lipozomlardaki orta konsantrasyonu ve kırmızı 10 mg DiD / mL lipozomlardaki yüksek konsantrasyonu gösterir. PBS ile muamele edilmiş bir fare, negatif kontrol (siyah) olarak kullanılmıştır. Kan (A, daire), inguinal yağ (B, triange) ve epididim adipoz (C, kare) enjeksiyondan 24 saat sonra toplandı ve tek hücreli bir süspansiyonu izole etmek için işlendi. Bu örnekler, tespit edilebilir DiD seviyesine kadar bir akış sitometresi üzerinde çalıştırıldı. Her tedavi grubunun bindirmeleri ile dokuya özgü histogramlar, konsantrasyon başına floresan yoğunluğunu göstermek için sunulmuştur (A\u2012C). DiD'nin aritmetik ortalaması da her doku ve konsantrasyon için ölçüldü ve çizildi (D). SSC = yan saçılma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Şekil 4: Yağ SVF, kan ve dalaktaki hücre alt kümelerinin temsili akış sitometrisi analizi. (A\u2012C) Yağ SVF (A), dalak (B) ve kandaki (C) hücre alt kümelerini ve DiD + hücrelerini tanımlamak için geçit stratejisinin şematik temsilcisi. Kısaltmalar: FSC = ileri saçılma; LD = canlı/ölü; L-DC'ler = lenfoid dendritik hücreler; M-DC'ler = miyeloid dendritik hücreler; SSC = yan saçılma. Bu rakam Osinski ve ark.3'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kontrol</td>
			<td>Amaç</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBS veya salin ile tedavi edilmiş fare</td>
			<td>Aşağıdaki akış sitometri kontrolleri için bu faredeki hücreleri kullanın:</td>
		</tr><tr><td>1. Lekelenmemiş hücreler</td>
		</tr><tr><td>2. Canlı / ölü tek leke</td>
		</tr><tr><td>3. Tam panel ile boyanmış, ancak analiz sırasında pozitif lipozom sinyalini belirlemek için lipozom floresansından yoksun hücreler</td>
		</tr><tr><td>Bu / bu fare / fareler, deneyimizde lipozom olmayan bir kontrole sahip olacağınız için lipozomların in vivo herhangi bir etkisi olup olmadığını belirlemek için de kullanılacaktır.</td>
		</tr><tr><td>Yüksüz lipozomlar</td>
			<td>Lipozomlarınıza bir bileşik yüklüyorsanız, lipozom partinizin bir kısmı bileşik olmadan sentezlenmelidir. Bu, tek başına lipozomların in vivo etkilerini açıklar.</td>
		</tr><tr><td>Tek başına DiD</td>
			<td>DiD, hücresel membranlar tarafından da alınabildiğinden, bazı farelerin lipozomlarda bulunana eşit miktarda serbest boya alması için tahsis edilmesi, herhangi bir arka plan zarı boyanmasının hesaba katılmasına yardımcı olacaktır.</td>
		</tr><tr><td>Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri</td>
			<td>Bunlar, panelinizdeki antikorlardan biri hariç hepsiyle boyanmış hücrelerdir. Yukarıdaki kutudaki #3 gibi, bu da analiz sırasında bu antikor için gerçek pozitif sinyalin belirlenmesine yardımcı olur</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Bu protokolde kullanılacak denetimler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Çözüm</td>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Toplu iş/fare başına gereken yaklaşık hacim</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lipozom preparatı</td>
		</tr><tr><td>Kalsiyum asetat</td>
			<td>H2O cinsinden 1 M kalsiyum asetat</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES tamponu</td>
			<td>H2O'da 10 mM HEPES, pH 7,4</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES sınırlarındaki Tesaglitazar</td>
			<td>10 mM HEPES içinde</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Doku toplama, işleme ve boyama</td>
		</tr><tr><td>Fosfat tamponlu çözelti (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, damıtılmışH2O'da 1,8 mM KH2PO 4</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparin</td>
			<td>PBS'de 0,1 mM Heparin</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES tamponu</td>
			<td>PBS'de 20 mM HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Sindirim tamponu</td>
			<td>HEPES tamponunda 2 mg/mL Kollajenaz Tip I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC lizis tamponu</td>
			<td>ddH 2 O cinsinden 0,158M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH7,2</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>FACS tamponu</td>
			<td>%1 BSA, PBS'de %0,05 NaN3</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr><tr><td>Fc Blok (seyreltilmiş)</td>
			<td>1:50 FACS tamponunda Fc Bloğu</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Fiksasyon Tamponu</td>
			<td>PBS'de %2 paraformaldehit</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Hazırlanacak çözümler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hücre Dışı Boyama (2x antikor karışımı)</td>
		</tr><tr><td>Antijen</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>100 μL test başına Ab hacmi</td>
			<td>Gerekli toplam hacim:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Sütun C x 1,2 x Toplam # örnekleri</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/test) x (1,2) x (# örnekler)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>ve saire...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Antikor karışımınızı oluşturmak için, D sütununda hesaplanan antikorları FACS tamponu veya Brilliant Violet Boyama Tamponu* ile birleştirerek son hacme (50 μL x 1,2 x Toplam # numune) kadar birleştirin</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Canlı/Ölü boyama (1x)</td>
		</tr><tr><td>Canlı/Ölü</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>200 uL testi başına L/D hacmi</td>
			<td>Gerekli toplam hacim:</td>
		</tr><tr><td>Canlı/Ölü</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Sütun C x 1,2 x Toplam # örnekleri</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hücre İçi Boyama (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antijen</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>50 μL test başına Ab hacmi</td>
			<td>Gerekli toplam hacim:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Sütun C x 1,2 x Toplam # örnekleri</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Panelinizde Parlak Mor florofora konjuge edilmiş birden fazla antikor kullanılıyorsa Parlak Menekşe Boyama Tamponu kullanılmalıdır.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Örnek antikor paneli ve akış boyama için kullanılacak boyama karışımlarının hesaplanması.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes at JoVE.com

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Bu protokolün amacı, floresan olarak etiketlenmiş lipozomları sentezlemek ve lipozomların hücresel düzeyde in vivo lokalizasyonunu tanımlamak için akış sitometrisini kullanmaktır.

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.1K Görüntüleme.  University of Virginia. Bu protokolün amacı, floresan olarak etiketlenmiş lipozomları sentezlemek ve lipozomların hücresel düzeyde in vivo lokalizasyonunu tanımlamak için akış sitometrisini kullanmaktır.

Video: Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Kapsamlı Usulü değerlendirin<em&gt; İn Vivo</em&gt; Kanser Nanomedicines performans

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Kanser Araştırmaları

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Gelişim Biyolojisi

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Biyomühendislik

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.

Perfüzyon Mekansal Ölçümler, Solid Tümörlerde interstisyel sıvı basınç ve lipozomlar Birikim

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and ...

Tıp

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biyoloji

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kapsamlı Usulü değerlendirin