Protokolümüz sorgum bitkisi gelişimi ve kuraklık direnci için epigenetik belirteçleri ortaya çıkarır. Bu tür bir moleküler anlayış, gelecekte ekinleri aşırı iklimlere uyarlamak için daha iyi çözümler geliştirmeye yardımcı olacaktır. Bu protokol, kitle spektrometresi ile çeviri sonrası değişikliklerin hedefsiz profillenimi için uygun sorgum yaprak dokusundan yüksek saflıkta histonlar üretir.
Prosedürü gösterenler, EMSL'den lisans sonrası araştırma ortakları Shadan Abdali ve Tanya Winkler olacak. Başlamak için, birkaç sorgum yaprağını sıvı nitrojenle öğütün ve eksi 80 santigrat derecede 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın. Her numunenin histon analizi için yaprak tozunun yaklaşık dört gramını kullanın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi ekstraksiyon tamponları 1, 2A ve 2B hazırlayın ve 0,2X'lik son konsantrasyonu yapmak için ekstraksiyon tamponuna bir proteaz inhibitörü tablet ekleyin. Daha sonra hazırlanan ekstraksiyon tamponunun 20 mililitresini öğütülmüş yaprak tozunun içine ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın veya girdaplayın. Mesh 100'ü kullanarak, filtrelenmiş malzemeyi her seferinde bir mililitre ekstraksiyon tamponu ile iki kez durulayın.
Daha sonra, hücre kalıntılarını ve büyük hücre altı organelleri peletmek için sallanan bir kova rotorunda filtratı 3.000 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Aynı zamanda, 0.4X'lik son konsantrasyona proteaz inhibitörü ekleyerek ekstraksiyon tamponu 2A'yı hazırlayın. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
Daha sonra peletı hazırlanan ekstraksiyon tamponu 2A'nın beş mililitresinde yeniden ıslatın. Hafifçe karıştırarak 10 dakika buzda kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi 2, 100 kez G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan bir kova rotorunda döküntü ve çekirdekleri peletmek için santrifüjleyin.
Peletin rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice dekant. Proteaz inhibitörlerini 1X'lik son konsantrasyona ekleyerek ekstraksiyon tamponu 2B'yi hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra elde edilen peletin içine bu hazırlanmış tampondan beş mililitre ekleyin.
2,100 kez G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan kova rotorunda pelet kalıntılarına ve çekirdeklere santrifüj. Aynı zamanda, bir proteaz inhibitörü tablet ekleyerek çekirdek lizis tamponu hazırlayın. Peletin rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice deklare edin ve peletin liziz tamponunun 250 mikrolitresinde yeniden dirildi.
Çözeltiyi homojenize etmek ve malzemeyi yeniden çıkarmak için maksimum hızda 15 saniye boyunca girdaplayın. Sonra dört santigrat derecede beş dakika sonicate ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Donmuş çekirdek örneğini çözün ve% 5 guanidin tamponunun 750 mikrolitresini ekleyin.
Sonra 4 santigrat derecede 15 dakika sonicate. Örneği iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de döndürün. Aynı zamanda, yüzeydeki kirlenmeyi en aza indirmek için iki mililitre asetonitril ve dört mililitre su ile durulayarak bir iyon değişim kromatografi sütunu hazırlayın.
Kromatografi sütununa yaklaşık 200 ila 300 mikrolitre zayıf katyon değişim reçinesi yükleyin ve reçinenin yerleşmesine izin verin. Reçineyi guanidin tamponu ile dört kez yıkayın ve tüpü ve kolonu buza yerleştirin. Sütunu iki mililitrelik bir toplama tüpüne koyun ve hazırlanan numuneden süpernatantı reçineyi bozmadan yavaşça reçine yatağına yükleyin.
Çözelti akarken, reçineye maksimum bağlamaya izin vermek için eluent'i sütunun üstüne altı ila sekiz kez geri yükleyin. Daha sonra histone olmayan proteinleri kolondan yıkamak için iki mililitre% 5 guanidin tamponu yükleyin. Histone proteinlerini bir mililitre% 5 guanidin tamponu ile elute edin ve unu toplayın.
Üç kilodalton kesme spin filtresini 500 mikrolitre yıkama çözücü ile temizleyin, ardından önceden temizlenmiş spin filtresini kullanarak kalan eluent'i tuzdan arındırın. LC-MS özellik haritasının belirli bölgelerinde deneyin başarısını gösteren büyük histone proteinleri gözlendi. Bu temsili harita kesikli kutularda bozulmamış tam uzunlukta histonları gösterir.
H2B ve 16 kilodalton H2A proteoformların LC-MS özellik haritası, her ikisinin de benzersiz ürün oturum numaralarında belirtildiği gibi benzer dizilere sahip birden fazla homologa sahip olduğunu göstermektedir. Uzun kuyrukları olmayan başka bir H2A histon grubu görülebilir. H4 histone proteinlerindeki N-terminal asetilasyon, ek lizin asetilasyonları ve metiyonin oksidasyonları burada gösterilen LC-MS özellik haritasındaki kütle farklılıkları incelenerek gözlemlenebilir.
H3 histone proteinleri için H3.3 ve H3.2 olmak üzere iki protein dizisi tanımlanmıştır. Elektron transferi ayrışması, tanımlanan H3.2 proteoformunun parçalanma spektrumunu oluşturmak için kullanıldı. Öncü iyonları ve önceki ve sonraki Ms1 spektrumları burada mor renkle vurgulanmış eşleştirilen izotop zirveleriyle gösterilir.
Çeviri sonrası değişiklikler sıra kapsama haritası kullanılarak yerelleştirilebilir. Proteoformların göreli bolluğu karşılaştırılarak, örnek koşullara özgü kesilmiş histone proteoformlarının değişiklikleri keşfedilmiştir. H4'ün C-terminal kesilmesi sadece bazı numuneler için üç ve dokuz hafta içinde gözlendi.
H3.2 için, N-terminal kesilmiş proteoformlar genellikle 10. Buna karşılık, C terminali kesilmiş H3.2 daha önceki zaman noktalarında görülmüştür. H4 C terminali kesilmiş proteoformlar BTx642'de RTx430'a göre önemli ölçüde daha fazlaydı.
Bu protokolü denerken, süpernatantın ve peletin renklerine çok dikkat edin. Renk değişimi, kloroplast taşlama veya lizisteki olası sorunların belirlenmesine yardımcı olun. Sorgum yapraklarından histon izolasyonu için bu sağlam protokolün diğer benzer bitkiler için epigenetik araştırmalara olanak sağlayacağını umuyoruz.
