بروتوكولنا يكشف علامات اللاجينية لتطوير نبات الذرة الرفيعة ومقاومة الجفاف. وسيساعد هذا الفهم الجزيئي على وضع حلول أفضل لتكييف المحاصيل مع المناخات الشديدة في المستقبل. يولد هذا البروتوكول هستونات عالية النقاء من أنسجة أوراق الذرة الرفيعة المناسبة للتوصيف غير المستهدف للتعديلات اللاحقة الترجمة بواسطة قياس الطيف الكتلي.
ومن خلال هذا الإجراء، سيكون شادان عبدلي وتانيا وينكلر، زميلا باحثين بعد البكالوريوس من EMSL. للبدء، طحن عدد قليل من أوراق الذرة الرفيعة مع النيتروجين السائل وتخزينها في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر في ناقص 80 درجة مئوية. استخدام ما يقرب من أربعة غرامات من مسحوق ورقة لتحليل هيستون لكل عينة.
إعداد مخازن الاستخراج 1 و 2A و 2B كما هو موضح في مخطوطة النص وإضافة قرص مثبطات البروتياز إلى مخزن الاستخراج واحد لجعل تركيز نهائي من 0.2X. ثم إضافة 20 ملليلتر من المخزن المؤقت الاستخراج المعدة واحد إلى مسحوق ورقة الأرض ومزيج بلطف أو دوامة لمدة 10 دقائق. باستخدام شبكة 100، شطف المواد المصفاة مرتين مع اثنين من ملليلتر من العازلة استخراج واحد في كل مرة.
بعد ذلك ، الطرد المركزي الترشيح في 3،000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية في الدوار دلو يتأرجح إلى بيليه حطام الخلية والعضيات تحت الخلايا الكبيرة. في الوقت نفسه، إعداد استخراج العازلة 2A عن طريق إضافة مثبطات البروتياز إلى تركيز النهائي من 0.4X. تجاهل المابير بدون إزعاج بيليه
ثم إعادة بناء بيليه في خمسة ملليلتر من العازلة استخراج المعدة 2A. احتضانه على الجليد لمدة 10 دقائق مع خلط لطيف. الطرد المركزي الحل في 2، 100 مرة G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية في الدوار دلو يتأرجح إلى بيليه الحطام والنوى.
Decant فائقة بعناية دون إزعاج بيليه. إعداد العازلة استخراج 2B عن طريق إضافة مثبطات protease إلى تركيز النهائي من 1X. إضافة خمسة ملليلتر من هذا العازلة المعدة إلى بيليه التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي.
أجهزة الطرد المركزي في 2، 100 مرة G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية في الدوار دلو يتأرجح إلى حطام بيليه والنوى. في الوقت نفسه ، قم بإعداد مخزن التحلل النووي عن طريق إضافة قرص مثبطات البروتياز. بعناية ديك المناط دون إزعاج بيليه وإعادة تعليق بيليه في 250 ميكرولترات من العازلة تحلل.
دوامة الحل لمدة 15 ثانية في السرعة القصوى لتجانس ذلك وإعادة تعليق المواد. ثم سونيكاته لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. ذوبان عينات نوى المجمدة وإضافة 750 ميكرولترات من 5٪ guanidine العازلة.
ثم سونيكاته لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل العينة إلى أنبوب مليلتر وتدور في 10، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. في الوقت نفسه، إعداد عمود كروماتوغرافي التبادل الأيوني عن طريق شطفه بمليلترين من الأسيتونتريل وأربعة ملليلترات من الماء لتقليل التلوث على السطح.
تحميل ما يقرب من 200 إلى 300 ميكرولترات من الراتنج تبادل الموجبة ضعيفة على عمود الكروماتوغرافيا والسماح لتسوية الراتنج. غسل الراتنج أربع مرات مع العازلة guanidine ووضع أنبوب وعمود على الجليد. وضع العمود على أنبوب جمع مليلتر وتحميل ناظر من العينة المعدة ببطء على سرير الراتنج دون تعطيل الراتنج.
كما يتم تدفق الحل من خلال، تحميل eluent مرة أخرى إلى أعلى العمود من ست إلى ثماني مرات للسماح أقصى ربط الراتنج. ثم تحميل مليلترين من 5٪ guanidine العازلة لغسل البروتينات غير هيستون قبالة العمود. Elute البروتينات هيستون مع ملليلتر واحد من 5٪ guanidine العازلة وجمع eluent.
تنظيف ثلاثة كيلودالون قص تدور التصفية مع 500 ميكرولترات من المذيبات غسل، ثم desalt eluent المتبقية باستخدام مرشح تدور تنظيفها مسبقا. ولوحظت بروتينات هيستون الرئيسية في مناطق محددة من خريطة خصائص LC-MS تشير إلى نجاح التجربة. تُظهر هذه الخريطة التمثيلية نغمات كاملة الطول سليمة في مربعات متقطعة.
خريطة ميزة LC-MS من H2B و 16 كيلودالون H2A proteoforms يبين أن كلا لها نفس متعددة مع تسلسلات مماثلة كما لوحظ من قبل أرقام دورة المنتج فريدة من نوعها. ويمكن رؤية مجموعة أخرى من h2A histones دون ذيول الموسعة. ويمكن ملاحظة أسيتيل N-المحطة الطرفية، واسيتيليشنات lysine إضافية، وأكسدة الميثيونين في بروتينات H4 Histone من خلال دراسة الاختلافات الكتلة في خريطة ميزة LC-MS هو موضح هنا.
كان هناك اثنين من تسلسل البروتين التي تم تحديدها لبروتينات H3 هيستون، H3.3 و H3.2. تم استخدام تجزئة انفصام نقل الإلكترونات لتوليد طيف التشظي للبروتيفورم H3.2 المحدد. وتظهر هنا أيونات السلائف وأطياف Ms1 السابقة والقادمة مع قمم النظائر المتطابقة التي تم تسليط الضوء عليها باللون الأرجواني.
يمكن ترجمة التعديلات اللاحقة باستخدام مخطط تغطية التسلسل. بمقارنة الوفرة النسبية للبروتيفورمات، تم اكتشاف تغيرات من بروتيوفورمات هينيو مقتطعة محددة لظروف العينة. ولم يلاحظ اقتطاع المحطة الطرفية C من H4 إلا في الأسبوعين الثالث والتاسعة لبعض العينات.
بالنسبة لH3.2، كانت البروتيفورمات المقتورة في المحطة N بشكل عام أكثر وفرة في الأسبوع 10. وعلى النقيض من ذلك، شوهدت محطة C الطرفية المقتطعة H3.2 في نقاط زمنية سابقة. كانت بروتيوفورمات H4 C-terminal المقتطعة أكثر وفرة في BTx642 مما كانت عليه في RTx430.
عند محاولة هذا البروتوكول، وإيلاء اهتمام وثيق لألوان من فوق و بيليه. تغيير اللون يساعد على تحديد المشاكل المحتملة في طحن أو تحلل من الكلوروبلاست. نأمل أن هذا البروتوكول القوي لعزل الحجر الهحي من أوراق الذرة الرفيعة سيمكن من إجراء أبحاث اللاجينية للنباتات الأخرى المماثلة.
