Notre protocole découvre des marqueurs épigénétiques pour le développement des plantes de sorgho et la résistance à la sécheresse. Une telle compréhension moléculaire aidera à développer de meilleures solutions pour adapter les cultures aux climats extrêmes à l’avenir. Ce protocole génère des histones de haute pureté à partir du tissu foliaire du sorgho adapté au profilage non ciblé des modifications post-translationnelles par spectrométrie de masse.
Shadan Abdali et Tanya Winkler, associés de recherche post-baccalauréat d’EMSL, démontreront la procédure. Pour commencer, moudre quelques feuilles de sorgho avec de l’azote liquide et les conserver dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres à moins 80 degrés Celsius. Utilisez environ quatre grammes de poudre de feuilles pour l’analyse de l’histone de chaque échantillon.
Préparez les tampons d’extraction 1, 2A et 2B tels que décrits dans le manuscrit du texte et ajoutez un comprimé inhibiteur de la protéase au tampon d’extraction pour faire une concentration finale de 0,2 X. Ajouter ensuite 20 millilitres de tampon d’extraction préparé à la poudre de feuilles moulues et mélanger délicatement ou vortex pendant 10 minutes. À l’aide du maillage 100, rincer le matériau filtré deux fois avec deux millilitres de tampon d’extraction un à chaque fois.
Ensuite, centrifugeuse le filtrate à 3000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor balançant seau pour pelleter les débris cellulaires et les grands organites subcellulaires. Simultanément, préparez le tampon d’extraction 2A en ajoutant un inhibiteur de la protéase à une concentration finale de 0,4 X. Jeter le surnatant sans déranger la pastille.
Puis résuspendez la pastille en cinq millilitres du tampon d’extraction préparé 2A. Incubez-le sur la glace pendant 10 minutes avec un mélange doux. Centrifuger la solution à 2 100 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans un rotor balançant pour pelleter les débris et les noyaux.
Décanter soigneusement le surnatant sans déranger la pastille. Préparer le tampon d’extraction 2B en ajoutant les inhibiteurs de la protéase à une concentration finale de 1X. Ajouter cinq millilitres de ce tampon préparé à la pastille obtenue après la centrifugation.
Centrifugeuse à 2 100 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans le rotor balançant du seau aux débris de granulés et aux noyaux. Simultanément, préparez le tampon de lyse de noyaux en ajoutant un comprimé inhibiteur de protéase. Décanter soigneusement le supernatant sans déranger la pastille et réutiliser la pastille dans 250 microlitres du tampon de lyse.
Vortex la solution pendant 15 secondes à vitesse maximale pour l’homogénéiser et résuspendre le matériau. Puis soniquez-le pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et rangez-le à moins 80 degrés Celsius. Décongeler l’échantillon de noyaux congelés et ajouter 750 microlitres de tampon de guanidine de 5 %.
Puis soniquez-le pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer l’échantillon dans un tube de deux millilitres et le faire tourner à 10 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Simultanément, préparez une colonne de chromatographie d’échange d’ion en la rinçant avec deux millilitres d’acétyonitrile et quatre millilitres d’eau pour minimiser la contamination à la surface.
Chargez environ 200 à 300 microlitres de résine d’échange de cation faible sur la colonne de chromatographie et laissez la résine se déposer. Lavez la résine quatre fois avec un tampon de guanidine et placez le tube et la colonne sur la glace. Placez la colonne sur un tube de collecte de deux millilitres et chargez le surnatant de l’échantillon préparé lentement sur le lit en résine sans perturber la résine.
Au fur et à mesure que la solution passe, chargez l’élitiste vers le haut de la colonne six à huit fois pour permettre une liaison maximale à la résine. Chargez ensuite deux millilitres de tampon guanidine de 5 % pour laver les protéines non histones de la colonne. Elute les protéines d’histone avec un millilitre de tampon de guanidine de 5% et de recueillir l’élitente.
Nettoyez un filtre à spin de coupure de trois kilodaltons avec 500 microlitres de solvant de lavage, puis désaltrez l’élitiste restant à l’aide du filtre à spin pré-nettoyé. Des protéines histones majeures ont été observées dans des régions spécifiques de la carte des caractéristiques de la LC-MS indiquant le succès de l’expérience. Cette carte représentative montre des histones pleine longueur intactes dans des boîtes pointillées.
La carte des caractéristiques LC-MS des protéoformes H2B et 16 kilodalton H2A montre que les deux ont plusieurs homologues avec des séquences similaires, comme le notent les numéros de session de produit uniques. Un autre groupe d’histones H2A sans queues étendues peut être vu. L’acétylation n-terminale, les acétylations supplémentaires de lysine, et les oxydations de méthionine dans les protéines d’histone de H4 peuvent être observées en examinant les différences de masse dans la carte de dispositif de LC-MS montrée ici.
Deux séquences protéiques ont été identifiées pour les protéines histones H3, H3.3 et H3.2. La fragmentation de dissociation de transfert d’électrons a été employée pour générer le spectre de fragmentation du protéoforme identifié de H3.2. Les ions précurseurs et les spectres Ms1 précédents et prochains sont montrés ici avec leurs pics isotopiques appariés mis en évidence en violet.
Les modifications post-translationnelles peuvent être localisées à l’aide de la carte de couverture des séquences. En comparant l’abondance relative des protéoformes, des changements des protéoformes tronqués d’histone spécifiques aux conditions d’échantillon ont été découverts. La troncature c-terminale de H4 n’a été observée que dans les semaines trois et neuf pour certains des échantillons.
Pour H3.2, les protéoformes tronqués n-terminal étaient généralement plus abondants dans la semaine 10. En revanche, le H3.2 tronqué de C-terminal a été vu dans les points précédents de temps. Les protéoformes tronqués du terminal H4 C étaient significativement plus abondants en BTx642 qu’en RTx430.
Lorsque vous essayez ce protocole, portez une attention particulière aux couleurs du surnatant et de la pastille. Le changement de couleur aide à identifier les problèmes potentiels dans le broyage ou la lyse du chloroplaste. Nous espérons que ce protocole robuste pour l’isolement histone des feuilles de sorgho permettra la recherche épigénétique pour d’autres plantes similaires.
