Nosso protocolo revela marcadores epigenéticos para o desenvolvimento de plantas de sorgo e resistência à seca. Tal compreensão molecular ajudará a desenvolver melhores soluções para adaptar as culturas para climas extremos no futuro. Este protocolo gera histones de alta pureza a partir de tecido de folha de sorgo adequado para perfil não direcionado de modificações pós-translacionais por espectrometria de massa.
Demonstrando o procedimento serão Shadan Abdali e Tanya Winkler, pós-bacharelados associados de pesquisa da EMSL. Para começar, triture algumas folhas de sorgo com nitrogênio líquido e armazene-as em um tubo de centrífuga de 50 mililitros a menos 80 graus Celsius. Use aproximadamente quatro gramas do pó de folha para análise de histona de cada amostra.
Prepare os buffers de extração 1, 2A e 2B conforme descrito no manuscrito do texto e adicione um comprimido inibidor de protease ao buffer de extração um para fazer uma concentração final de 0,2X. Em seguida, adicione 20 mililitros do tampão de extração preparado um ao pó da folha moída e misture suavemente ou vórtice por 10 minutos. Utilizando a malha 100, enxágue o material filtrado duas vezes com dois mililitros de tampão de extração um cada vez.
Em seguida, centrifugar o filtrado a 3.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de balde balançando para pelotar os detritos celulares e grandes organelas subcelulares. Simultaneamente, prepare o tampão de extração 2A adicionando o inibidor de protease a uma concentração final de 0,4X. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
Em seguida, resuspenha a pelota em cinco mililitros do tampão de extração preparado 2A. Incubar no gelo por 10 minutos com mistura suave. Centrifugar a solução a 2.100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de balde balançando para pelotar os detritos e núcleos.
Decante o supernatante cuidadosamente sem perturbar a pelota. Prepare o tampão de extração 2B adicionando os inibidores de protease a uma concentração final de 1X. Adicione cinco mililitros deste tampão preparado à pelota obtida após a centrifugação.
Centrífuga a 2.100 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius no rotor de balde balançando para detritos de pelotas e núcleos. Simultaneamente, prepare o tampão de lise dos núcleos adicionando um comprimido inibidor de protease. Decante cuidadosamente o supernascer sem perturbar a pelota e resuspense a pelota em 250 microliters do tampão de lise.
Vórtice a solução por 15 segundos em velocidade máxima para homogeneizá-la e resuspensá-la. Em seguida, sonicate-lo por cinco minutos a quatro graus Celsius e armazená-lo a menos 80 graus Celsius. Descongele a amostra de núcleos congelados e adicione 750 microliters de 5% de tampão de guanidina.
Em seguida, sonicate-lo por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a amostra para um tubo de dois mililitros e gire-a a 10.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Simultaneamente, prepare uma coluna de cromatografia de troca de íons enxaguando-a com dois mililitros de acetonitrilo e quatro mililitros de água para minimizar a contaminação na superfície.
Carregue aproximadamente 200 a 300 microliters de fraca resina de troca de cálice na coluna cromatografia e deixe a resina se instalar. Lave a resina quatro vezes com tampão de guanidina e coloque o tubo e a coluna no gelo. Coloque a coluna em um tubo de coleta de dois mililitros e carregue o sobrenante da amostra preparada lentamente na cama de resina sem interromper a resina.
À medida que a solução está fluindo, carregue o eluent de volta ao topo da coluna seis a oito vezes para permitir a ligação máxima à resina. Em seguida, carregue dois mililitros de tampão de 5% de guanidina para lavar as proteínas não histonas da coluna. Elute as proteínas histonas com um mililitro de 5% de tampão de guanidina e colete o eluent.
Limpe um filtro de giro de corte de três quilodaltons com 500 microliters de solvente de lavagem e, em seguida, desalente o eluent restante usando o filtro de giro pré-limpo. As principais proteínas histonas foram observadas em regiões específicas do mapa de características LC-MS indicando o sucesso do experimento. Este mapa representativo mostra histones intactos em caixas tracejadas.
O mapa de recursos LC-MS de proteoforms H2B e 16 kilodalton H2A mostra que ambos têm vários homólogos com sequências semelhantes, como observado pelos números exclusivos da sessão do produto. Outro grupo de histones H2A sem as caudas estendidas pode ser visto. A acetilação n-terminal, acetilações adicionais de lysina e oxidações de methionina em proteínas histonas H4 podem ser observadas examinando as diferenças de massa no mapa de características LC-MS mostrado aqui.
Foram identificadas duas sequências proteicas para proteínas de histona H3, H3.3 e H3.2. A fragmentação da dissociação da transferência de elétrons foi usada para gerar o espectro de fragmentação do proteoforme H3.2 identificado. Os íons precursores e os espectros anterior e seguinte da Ms1 são mostrados aqui com seus picos de isótopos combinados destacados em roxo.
Modificações pós-translacionais podem ser localizadas usando o mapa de cobertura de sequência. Comparando-se a abundância relativa dos proteoformes, foram descobertas alterações de proteoformas de histona truncadas específicas às condições amostrais. A truncação terminal C de H4 foi observada apenas nas semanas três e nove para algumas das amostras.
Para h3.2, os proteoformes truncados n-terminal foram geralmente mais abundantes na semana 10. Em contraste, o terminal C truncado H3.2 foi visto em pontos de tempo anteriores. Os proteoformes truncados do terminal H4 C foram significativamente mais abundantes em BTx642 do que em RTx430.
Ao tentar este protocolo, preste muita atenção às cores do supernatante e da pelota. A mudança de cor ajuda a identificar possíveis problemas na moagem ou lise do cloroplasto. Esperamos que este protocolo robusto para o isolamento de histono das folhas de sorgo permita pesquisa epigenética para outras plantas semelhantes.
