הפרוטוקול שלנו חושף סמנים אפיגנטיים לפיתוח צמחי דורה ועמידות לבצורת. הבנה מולקולרית כזו תסייע לפתח פתרונות טובים יותר להתאמת יבולים לאקלים קיצוני בעתיד. פרוטוקול זה יוצר היסטון טוהר גבוה מרקמת עלה דורה מתאים ליצירת פרופיל לא ממוקד של שינויים שלאחר תרגום על ידי ספקטרומטריית מסה.
להדגים את ההליך יהיו שאדן עבדלי וטניה וינקלר, עמיתי מחקר פוסט-רווקים מ-EMSL. כדי להתחיל, לטחון כמה עלי דורה עם חנקן נוזלי ולאחסן אותם בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש כארבעה גרם של אבקת עלה לניתוח היסטון של כל מדגם.
הכן מאגרי מיצוי 1, 2A ו- 2B כמתואר בכתב היד של הטקסט והוסף לוח מעכב פרוטאז למאגר מיצוי אחד כדי ליצור ריכוז סופי של 0.2X. לאחר מכן מוסיפים 20 מיליליטר של מאגר החילוץ המוכן לאבקת עלה הקרקע ומערבבים בעדינות או מערבולת במשך 10 דקות. באמצעות רשת 100, לשטוף את החומר מסונן פעמיים עם שני מיליליטר של חיץ החילוץ אחד בכל פעם.
לאחר מכן, צנטריפוגה הסינון ב 3, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד כדי גלולות פסולת התא אברונים תת תאיים גדולים. בו זמנית, להכין את החילוץ מאגר 2A על ידי הוספת מעכב פרוטאז לריכוז הסופי של 0.4X. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.
ואז resuspend גלולה בחמישה מיליליטר של מאגר החילוץ מוכן 2A. דגירה אותו על קרח במשך 10 דקות עם ערבוב עדין. צנטריפוגה הפתרון ב 2, 100 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד כדי גלולות הפסולת וגרעינים.
Decant supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולה. הכן את מאגר החילוץ 2B על ידי הוספת מעכבי פרוטאז לריכוז הסופי של 1X. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ מוכן זה לכדור שהושג לאחר הצנטריפוגה.
צנטריפוגה ב 2, 100 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד לפסולת גלולה וגרעינים. בו זמנית, להכין מאגר תמוגה גרעינית על ידי הוספת לוח מעכבי פרוטאז. בזהירות decant supernatant מבלי להפריע גלולה resuspend גלולה ב 250 microliters של מאגר תמוגה.
וורטקס הפתרון במשך 15 שניות במהירות המרבית כדי הומוגניזציה זה resuspend את החומר. ואז sonicate אותו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את דגימת הגרעינים הקפואים ולהוסיף 750 microliters של 5% חוצץ guanidine.
ואז sonicate אותו במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את הדגימה לצינור של 2 מיליליטר ומסובבים אותה ב-10,000 פעמים ג' למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. בו זמנית, להכין עמוד כרומטוגרפיה חילופי יון על ידי שטיפה אותו עם שני מיליליטר של אצטוניטריל וארבעה מיליליטר של מים כדי למזער את הזיהום על פני השטח.
טען כ-200 עד 300 מיקרוליטרים של שורי חילופי קטיון חלשים על עמוד הכרומטוגרפיה ותן לשרפן להתיישב. לשטוף את הצב ארבע פעמים עם חיץ guanidine ומניחים את הצינור ואת העמוד על הקרח. שים את העמודה על צינור איסוף שני מיליליטר ולטעון את supernatant מן המדגם מוכן לאט על המיטה בשרף מבלי לשבש את בשרף.
כאשר הפתרון זורם, טען את האלונט בחזרה לראש העמודה שש עד שמונה פעמים כדי לאפשר איגוד מרבי לשרעף. ואז לטעון שני מיליליטר של 5% חוצץ guanidine לשטוף את החלבונים שאינם histone את הטור. יש לאסוף את חלבוני ההיסטון במיליליטר אחד של 5% מגואנידין ולאסוף את האלונט.
נקה מסנן ספין ניתוק שלושה קילודלטון עם 500 microliters של ממס לשטוף, ואז לפתור את האלונט הנותרים באמצעות מסנן ספין מראש ניקה. חלבוני היסטון עיקריים נצפו באזורים מסוימים של מפת התכונות LC-MS המציינת את הצלחת הניסוי. מפה מייצגת זו מציגה היסטונים שלמים באורך מלא בתיבות מקווקוות.
מפת התכונות LC-MS של H2B ו- 16 פרוטאופורות H2A של קילודאלטון מראה כי לשניהם יש הומולוגים מרובים עם רצפים דומים כפי שצוין על ידי מספרי הפעלת המוצר הייחודיים. קבוצה נוספת של היסטונים H2A ללא הזנבות המורחבים ניתן לראות. אצטילציה N-מסוף, אצטילציות ליסין נוספות, חמצון מתיון בחלבוני H4 histone ניתן לראות על ידי בחינת ההבדלים ההמוניים במפת תכונה LC-MS המוצג כאן.
היו שני רצפי חלבון שזוהו עבור חלבוני H3 histone, H3.3 ו H3.2. פיצול ניתוק העברת אלקטרונים שימש ליצירת ספקטרום הפיצול של פרוטאופורם H3.2 שזוהה. יוני המבשר והספקטרום הקודם והבא של Ms1 מוצגים כאן עם פסגות האיזוטופ התואמות שלהם מודגשות בסגול.
ניתן לבצע התאמות לאחר התרגום באמצעות מפת כיסוי הרצף. על ידי השוואת השפע היחסי של proteoforms, שינויים של פרוטאופורמים histone קטוע ספציפי לתנאי מדגם התגלו. חיתוך C-מסוף של H4 נצפתה רק בשבועות שלוש ותשע עבור חלק מהדגימות.
עבור H3.2, פרוטאופורות קטועות N-terminal היו בדרך כלל בשפע יותר בשבוע 10. לעומת זאת, C-מסוף חתוך H3.2 נראו בנקודות זמן קודמות. פרוטאופורות חיתוך מסוף C H4 היו בשפע באופן משמעותי יותר BTx642 מאשר ב RTx430.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, לשים לב לצבעים של supernatant ואת גלולה. שינוי הצבע מסייע בזיהוי בעיות פוטנציאליות בטחינה או תמוגה של הכלורופלסט. אנו מקווים כי פרוטוקול חזק זה לבידוד היסטון מעלי דורה יאפשר מחקר אפיגנטי עבור צמחים דומים אחרים.
