우리의 프로토콜은 사탕 수 수 식물 개발 및 가뭄 저항에 대한 후성 유전학 마커를 발견합니다. 이러한 분자 이해는 미래의 극단적 인 기후에 대한 작물을 적응하는 더 나은 솔루션을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜은 질량 분석법에 의한 번역 후 수정의 미표적 프로파일링에 적합한 사탕잎 조직에서 고순도 히스톤을 생성한다.
절차를 시연하는 것은 샤단 압달리와 타냐 윙클러, EMSL에서 학사 후 연구 동료가 될 것입니다. 우선, 액체 질소로 사탕수수 잎 몇 잎을 갈아서 섭씨 영하 80도에서 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 보관하십시오. 각 샘플의 히스톤 분석을 위해 약 4 그램의 잎 분말을 사용하십시오.
텍스트 원고에 설명된 대로 추출 버퍼 1, 2A 및 2B를 준비하고 추출 버퍼 에 프로테아제 억제제 정제를 추가하여 최종 농도를 0.2배 로 만듭니다. 그런 다음 준비된 추출 버퍼 20밀리리터를 분쇄 잎 분말에 넣고 10분 동안 부드럽게 혼합하거나 소용돌이를 만듭니다. 메쉬 100을 사용하여 여과된 재료를 매번 하나씩 추출 버퍼 2밀리리터로 두 번 헹구습니다.
다음으로, 분과류는 3, 000배 G에서 10분 동안 스윙 버킷 로터에서 세포 파편과 큰 세포 세포 세포를 펠렛으로 처리합니다. 동시에 최종 농도0.4X에 프로테아제 억제제를 추가하여 추출 버퍼 2A를 준비한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
그런 다음 준비된 추출 버퍼 2A의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 부드러운 혼합으로 10 분 동안 얼음에 배양하십시오. 원심분리기는 2, 100회 G에서 15분간 4도에서 4도의 G로, 스윙 버킷 로터에서 이물질과 핵을 펠렛합니다.
펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 장식합니다. 프로테아제 억제제를 1X의 최종 농도에 추가하여 추출 버퍼 2B를 준비한다. 원심 분리 후 얻은 펠릿에 이 준비된 버퍼 5밀리리터를 추가합니다.
원심분리기는 2, 100회 G에서 15분간 스윙 버킷 로터에서 4°C에서 펠릿 파편과 핵을 배출합니다. 동시에 프로테아제 억제제 정제를 추가하여 핵 용해 완충제를 준비한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 신중하게 데칭하고 리시스 버퍼의 250 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
최대 속도로 15초 동안 용액을 소용돌이어 균질화하고 재보습합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5 분간 초음파 처리하여 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 냉동 핵 샘플을 해동하고 5%의 구아니딘 완충제의 750 마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 15 분 동안 초음파 처리하십시오. 샘플을 2 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 10, 000회 G로 회전합니다. 동시에, 표면의 오염을 최소화하기 위해 아세토닐레 2밀리리터와 4밀리리터의 물로 헹구어 이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 준비한다.
약 200 내지 300 마이크로리터의 약한 양이온 교환 수지를 크로마토그래피 컬럼에 적재하고 수지정착을 한다. 관니딘 버퍼로 수지네 번 씻고 튜브와 컬럼을 얼음 위에 놓습니다. 2 밀리리터 수집 튜브에 컬럼을 넣고 준비된 샘플에서 상체를 수지 침대에 천천히 적재하여 수지침을 방해하지 않습니다.
용액이 흐르면서 용액을 열 의 맨 위로 6~8번 로드하여 수지에 최대 바인딩을 허용합니다. 그런 다음 5%의 구아니딘 버퍼 2밀리리터를 적재하여 비히스톤 단백질을 컬럼에서 씻어낸다. 5%의 구아니딘 버퍼1밀리리터로 히스톤 단백질을 엘테우트와 용액을 수집합니다.
3킬로달톤 컷오프 스핀 필터를 500마이크로리터의 세척 용매로 청소한 다음, 미리 세척된 스핀 필터를 사용하여 나머지 용액을 탈염합니다. 주요 히스톤 단백질은 LC-MS 기능 맵의 특정 영역에서 관찰되어 실험의 성공을 나타낸다. 이 대표적인 맵은 파선 된 상자에 그대로 전체 길이 히스톤을 보여줍니다.
H2B 및 16킬로달튼 H2A 프로테오폼의 LC-MS 기능 맵은 둘 다 고유한 제품 세션 번호에 의해 언급된 것과 유사한 시퀀스를 가진 여러 개의 동형 모로그를 가지고 있음을 보여줍니다. 확장 된 꼬리가없는 H2A 히스톤의 또 다른 그룹을 볼 수 있습니다. H4 히스톤 단백질의 N-말단 아세틸화, 추가 리신 아세틸레이션 및 메티오닌 산화는 여기에 표시된 LC-MS 기능 맵의 질량 차이를 검사하여 관찰될 수 있다.
H3 히스톤 단백질, H3.3 및 H3.2에 대해 확인된 두 가지 단백질 서열이 있었습니다. 전자 전달 해리 단편화는 확인된 H3.2 프로테오폼의 단편화 스펙트럼을 생성하는 데 사용되었다. 전구체 이온과 이전 및 다음 Ms1 스펙트럼은 보라색으로 강조 표시된 일치하는 동위원소 봉우리와 함께 여기에 표시됩니다.
번역 후 수정은 시퀀스 커버리지 맵을 사용하여 지역화할 수 있습니다. 프로테오폼의 상대적 풍부를 비교함으로써, 샘플 조건에 특정한 잘린 히스톤 프로테오폼의 변화가 발견되었다. H4의 C-말단 잘림은 샘플 중 일부에 대해 3주와 9주에서만 관찰되었다.
H3.2의 경우, N단자 잘린 프로테오폼은 일반적으로 10주에 더 풍부했다. 반면 C-단말이 H3.2를 잘린 것을 앞세이 시점에서 볼 수 있었다. H4 C-단말 잘린 프로테오폼은 RTx430보다 BTx642에서 훨씬 더 풍부했습니다.
이 프로토콜을 시도할 때, 상수와 펠릿의 색상에 주의를 기울이십시오. 색상 변경은 엽록소의 연삭 또는 리시스에서 잠재적인 문제를 식별하는 데 도움이 됩니다. 우리는 사탕 수잎에서 그의 음색 격리에 대한이 강력한 프로토콜이 다른 유사한 식물에 대한 후생 유전학 연구를 가능하게 할 수 있기를 바랍니다.
