Unser Protokoll deckt epigenetische Marker für die Entwicklung von Sorghumpflanzen und Dietrockenheit auf. Ein solches molekulares Verständnis wird dazu beitragen, bessere Lösungen zu entwickeln, um Pflanzen in Zukunft an extreme Klimazonen anzupassen. Dieses Protokoll erzeugt hochreine Histone aus Sorghumblattgewebe, das für eine ungezielte Profilierung posttranslationaler Modifikationen durch Massenspektrometrie geeignet ist.
Demonstriert werden Shadan Abdali und Tanya Winkler, Post-Bachelor-Forschungsmitarbeiter von EMSL. Zunächst ein paar Sorghumblätter mit flüssigem Stickstoff mahlen und in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei minus 80 Grad Celsius lagern. Verwenden Sie etwa vier Gramm des Blattpulvers für die Histonanalyse jeder Probe.
Bereiten Sie die Extraktionspuffer 1, 2A und 2B wie im Textmanuskript beschrieben vor und fügen Sie eine Protease-Hemmer-Tablette zu Extraktionspuffer eins hinzu, um eine endgültige Konzentration von 0,2X zu erreichen. Dann 20 Milliliter des vorbereiteten Extraktionspuffers zum gemahlenen Blattpulver geben und 10 Minuten lang sanft mischen oder wirbeln. Spülen Sie das gefilterte Material mit Mesh 100 zweimal mit zwei Millilitern Extraktionspuffer eins jedes Mal.
Als nächstes zentrifugieren Sie das Filtrat bei 3.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor, um den Zellabfall und große subzelluläre Organellen zu pellet. Gleichzeitig bereiten Sie extraktionspuffer 2A vor, indem Sie Protease-Inhibitor zu einer Endkonzentration von 0,4X hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
Dann das Pellet in fünf Millilitern des vorbereiteten Extraktionspuffers 2A wieder aufhängen. 10 Minuten lang mit sanftem Mischen auf Eis bebrüten. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 2, 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor, um die Trümmer und Kerne zu pellet.
Dekantieren Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Pellet zu stören. Bereiten Sie Extraktionspuffer 2B vor, indem Sie die Protease-Inhibitoren zu einer Endkonzentration von 1X hinzufügen. Fügen Sie dem nach der Zentrifugation erhaltenen Pellet fünf Milliliter dieses vorbereiteten Puffers hinzu.
Zentrifuge bei 2, 100 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius im schwingenden Schaufelrotor zu Pelletschutt und Kernen. Gleichzeitig einen Kernlysepuffer vorbereiten, indem Sie eine Protease-Hemmer-Tablette hinzufügen. Den Überstand vorsichtig dekantieren, ohne das Pellet zu stören, und das Pellet in 250 Mikroliter des Lysepuffers wieder aufhängen.
Wirbel die Lösung für 15 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit, um es zu homogenisieren und das Material wieder aufzuhängen. Dann beschallen Sie es für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Die gefrorene Kernprobe auftauen und 750 Mikroliter 5%Guanidinpuffer hinzufügen.
Dann beschallen Sie es für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Probe auf ein Zwei-Milliliter-Rohr und drehen Sie sie bei 10.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Gleichzeitig bereiten Sie eine Ionenaustauschchromatographie-Säule vor, indem Sie sie mit zwei Milliliteracetonitril und vier Milliliter Wasser spülen, um die Kontamination an der Oberfläche zu minimieren.
Etwa 200 bis 300 Mikroliter schwachen Kationenaustauschharzes auf die Chromatographiesäule laden und das Harz absetzen lassen. Waschen Sie das Harz viermal mit Guanidinpuffer und legen Sie die Röhre und Säule auf Eis. Legen Sie die Säule auf ein Zwei-Milliliter-Sammelrohr und laden Sie den Überstand aus der vorbereiteten Probe langsam auf das Harzbett, ohne das Harz zu stören.
Wenn die Lösung durchfließt, laden Sie das Eluent sechs- bis achtmal wieder an die Spitze der Säule, um eine maximale Bindung an das Harz zu ermöglichen. Dann zwei Milliliter 5%Guanidinpuffer laden, um die nicht-histonen Proteine von der Säule zu waschen. Elute die Histonproteine mit einem Milliliter 5%GuanidinPuffer und sammeln Sie das Eluent.
Reinigen Sie einen drei Kilodalton Cutoff Spin Filter mit 500 Mikroliter Waschlösungsmittel, dann entsalzen Sie das restliche Eluent mit dem vorgereinigten Spinfilter. Wichtige Histonproteine wurden in bestimmten Regionen der LC-MS-Featurekarte beobachtet, die auf den Erfolg des Experiments hinweisen. Diese repräsentative Karte zeigt intakte Histones in voller Länge in gestrichelten Boxen.
Die LC-MS-Featurekarte von H2B und 16 Kilodalton H2A Proteoformen zeigt, dass beide mehrere Homologe mit ähnlichen Sequenzen haben, wie die eindeutigen Produktsitzungsnummern zeigen. Eine andere Gruppe von H2A-Histonen ohne die verlängerten Schwänze ist zu sehen. Die N-terminale Acetylierung, zusätzliche Lysin-Acetylierungen und Methionin-Oxidationen in H4-Histonproteinen können beobachtet werden, indem die Massenunterschiede in der hier gezeigten LC-MS-Featurekarte untersucht werden.
Für H3-Histonproteine, H3.3 und H3.2, wurden zwei Proteinsequenzen identifiziert. Die Fragmentierung der Elektronentransferdissoziation wurde verwendet, um das Fragmentierungsspektrum des identifizierten H3.2-Proteoform zu erzeugen. Die Vorläuferionen und die vorherigen und nächsten Ms1-Spektren werden hier mit ihren abgestimmten Isotopenspitzen in Violett dargestellt.
Post-translationale Änderungen können mithilfe der Sequenzabdeckungskarte lokalisiert werden. Durch den Vergleich der relativen Häufigkeit der Proteoformen wurden Veränderungen der abgeschnittenen Histonproteoformen entdeckt, die spezifisch für Probenbedingungen sind. C-Terminal-Abschneidung von H4 wurde nur in den Wochen drei und neun für einige der Proben beobachtet.
Für H3.2 waren N-Terminal abgeschnittene Proteoformen in der Regel häufiger in Woche 10. Im Gegensatz dazu wurden C-Terminal abgeschnitten H3.2 wurden in früheren Zeitpunkten gesehen. Die H4 C-Terminal abgeschnittenen Proteoformen waren bei BTx642 deutlich häufiger als bei RTx430.
Achten Sie beim Versuch dieses Protokolls auf die Farben des Überstandes und des Pellets. Der Farbwechsel hilft, mögliche Probleme beim Schleifen oder Lyse des Chloroplasten zu identifizieren. Wir hoffen, dass dieses robuste Protokoll zur Histonisolation von Sorghumblättern epigenetische Forschung für andere ähnliche Pflanzen ermöglichen wird.
