Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Protokol oluşturma sürecindeki fikirleri ve tartışmaları için Dr. Julia Fine'a ve düzenleme boyunca yararlı yorumları için Dr. Cassondra Vernier'e teşekkür ederiz. Bu materyaller, kısmen Gıda ve Tarım Araştırmaları Vakfı tarafından hibe kimliği 549025 kapsamında desteklenen projelere katkıda bulunmuştur.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, larva toplama ve virüs yayılımı, ekstraksiyonu ve konsantrasyonunun yanı sıra kafes besleme deneyleri şeklinde viral tedavi de dahil olmak üzere virüs amplifikasyonu ve inokülum stok hazırlama sürecinin her adımını detaylandıran yöntemleri özetledik. Bu yöntemler, etkinliği yetişkinler için ölümcül olan virüsler için doz-yanıt mortalite testi ile tutarlı bir şekilde ölçülebilen yarı saf virüs parçacıklarının üretilmesine izin verir (<strong cla...

Bal arıları (Apis mellifera) modern küresel tarım alanında kritik bir rol oynamaktadır, ancak şu anda pestisit maruziyeti, zayıf yem, parazitler ve patojenler dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik stresörlerin bir kombinasyonundan muzdariptir 1,2. Endişe verici en önemli patojenlerden biri, birçoğu büyük bal arısı stresörlerinden biri olan parazitik Varroa akarı (Varroa yıkıcı) tarafından vektörleştirilen virüslerdir. Bu virüsler, bal arılarında azalmış yavru sağkalımı, gelişimsel kusurlar ve felç dahil olmak üzere bir dizi olumsuz etkiye neden olabilir ve bu da kışlama dönemlerinden önce ve sonra toplam kovan çöküşüne yol açabilir 3,4,5. Virüs enfeksiyonu ile mücadelede kullanılan teknolojilerin geliştirilmesinde umut verici ilerlemeler olmasına rağmen 6,7,8,9, birçok virüsün bir bal arısı veya kolonisi içinde yayıldığı, yayıldığı ve etkileşime girdiği dinamikler hala tam olarak anlaşılamamıştır 5,10 . Bal arısı ve virüs etkileşimlerinin temel biyolojisini ve diğer çevresel faktörlerle ilişkilerini anlamak, etkili virüs yönetimi teknikleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
Bununla birlikte, bal arısı-virüs etkileşimlerini incelemek, süreci zorlaştıran çok sayıda bilinen ve bilinmeyen faktörle ilgili zorluklar ortaya koymaktadır. Bunlar diyet 11,12, pestisit maruziyeti 13 ve arı genetik arka planı14,15 ile etkileşimleri içerir. Sadece virüs enfeksiyonuna odaklanıldığında bile, komplikasyonlar yaygındır, çünkü hem yönetilen hem de vahşi bal arısı popülasyonları, genellikle akut semptomlar göstermeden 16,17 ve virüs koenfeksiyonunun etkileri iyi anlaşılmamıştır18. Bu, bal arısı virüsü etkilerinin incelenmesini çözülmeyi zorlaştırmıştır.
Birçok bal arısı virüsü çalışması, arka plan enfeksiyonlarının diğer tedavilerle nasıl değiştiğini gözlemleyerek, diğer stresörlerle etkileşimleri aramak için durumsal virüs enfeksiyonlarını kullanmıştır 12,19,20,21. Bu yaklaşım, özellikle pestisit veya diyet tedavilerinin virüs seviyelerini ve replikasyonunu nasıl etkilediğini keşfetmede önemli etkileri belirlemede başarılı olsa da, bilinen içerik ve konsantrasyonun bir virüs tedavisi ile aşılama, virüs enfeksiyon dinamiklerinin deneysel olarak test edilmesi için kritik öneme sahiptir. Yine de, deneysel tedaviyi arka plan enfeksiyonundan ayırmak da zorluklar doğurabilir. Saha çalışmalarında, araştırmacılar bal arılarından bombus arılarına virüs bulaşması için kanıt sağlamak için deforme olmuş kanat virüsü (DWV) suşlarını farklılaştırdılar22, ancak bu yaklaşımı kullanmak yalnızca bal arıları içinde zor olacaktır. Virüs enfeksiyöz klonları, sadece enfeksiyonu izlemek için değil 23,24,25 değil, bal arısı virüslerinin ters genetik çalışmaları ve virüs-konakçı etkileşim araştırması 26,27,28 için de güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çoğu durumda, parçacıklar üretmek için hücrelerin içindeki enfeksiyon döngüsünü yerine getirmek için bulaşıcı klonlara hala ihtiyaç vardır. Bu tür parçacıklar deneysel tedaviler için inoküla olarak tercih edilir, çünkü enfektiviteleri çıplak viral RNA'dan daha yüksektir ve kapsüllenmiş genomlarla aşılama doğal bir enfeksiyonu taklit eder.
Saf, kirlenmemiş bal arısı virüsü inocula'nın (vahşi tip virüs suşları veya bulaşıcı klonlardan türetilenler) üretimi de zorluklar doğurmaktadır. Bunlar temel olarak, saf suş virüsleri üretmek için güvenilir, sürekli çoğalan, virüssüz bir bal arısı hücre hattı elde etmedeki zorluklardan kaynaklanmaktadır29,30. Bazı hücre hatları üretilirken, bu sistemler kusurlu kalır; Yine de, virüs üretiminin ve araştırmasının daha iyi kontrol edilmesini sağlayacak uygulanabilir bir hücre hattının29 üretilebileceği umudu var. Böyle bir hat yaygın olarak kullanılabilir hale gelene kadar, çoğu virüs üretim protokolü in vivo virüs üretimi ve saflaştırma18,31,32,33,34 kullanımına güvenmeye devam edecektir. Bu yaklaşımlar, ilgilenilen virüs parçacıklarını tanımlamayı ve saflaştırmayı (veya bulaşıcı bir klon üretmeyi) ve bunları genellikle pupa olarak bal arılarını enfekte etmek için kullanmayı içerir. Pupa hedef virüs ile enjekte edilir ve daha sonra kurban edilir ve daha fazla parçacık ekstrakte edilir ve saflaştırılır. Bununla birlikte, başlangıçta hiçbir arı virüssüz olmadığından, bu tür bir konsantredeki diğer virüslerin izlerinden her zaman bir dereceye kadar kontaminasyon vardır ve bu nedenle, arka plan enfeksiyonları olasılığı düşük olan arıların seçiminde büyük özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu protokollerde kullanılmak üzere pupaları tarak hücrelerinden çıkarma yöntemleri33 çok emek yoğundur ve arılarda strese neden olabilir, bu sayede üretimi sınırlayabilir 18,32. Burada, larvaların az emek ve arılar üzerinde daha az mekanik stres ile büyük ölçekli olarak uzaklaştırılmasını sağlayan alternatif bir yöntem sunuyoruz.
Pupa elde edildikten ve başlangıç virüsü inokulumu ile enjekte edildikten sonra, virüsün çoğalmasını sağlamak için inkübe edilmeleri gerekir. Daha sonra, üretilen virüs parçacıkları, deneysel arıları enfekte etmek için kullanılabilecek bir formda işlenebilir. Bunu başarmak için, bir enfeksiyon kaynağı olarak ham homojenat35,36 veya viral olarak enfekte arılardan üretilen hemolenf kullanmak da dahil olmak üzere birkaç basit yöntem vardır37. Bu yöntemler etkilidir, ancak arka plan substratından bilinmeyen değişkenleri (örneğin, ölü arı homojenatlarındaki diğer faktörler) sokma şansı daha yüksektir. Ek olarak, bir deney kısa sürede büyük, bilinen bir virüs dozu vermeyi gerektiriyorsa, parçacıkların konsantre edilmesi arzu edilir. Bu nedenle, daha iyi kontrol için, virüs parçacıklarının bir miktar saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren yöntemlerin kullanılması tercih edilir. Genel olarak, bir dizi yağış ve santrifüjleme adımı, neredeyse tüm olası hedef dışı virüs materyalinin çıkarılmasıyla sonuçlanacaktır33.
Bu konsantre inokulumu ürettikten sonra, viral titreleri (qPCR) ölçmek ve canlılığını ve mortaliteye neden olma yeteneğini test etmek ve enfeksiyondan sonra artan virüs titrelerinin elde edildiğini doğrulamak için in vivo biyotahlillerle karakterize etmek faydalıdır. Bu, enjeksiyon deneyleri (pupa veya yetişkinlere) veya beslenme deneyleri (larvalara veya yetişkinlere) yoluyla elde edilebilir. Tüm bu yaklaşımlar mümkün olsa da, bir kafeste yetişkin arı gruplarına beslenme genellikle en hızlı ve en basit olanıdır. Kafes testi yöntemi, pestisit toksisitesi38, yumurtalık gelişimi39 ve davranış üzerindeki beslenme etkisi 40,41 dahil olmak üzere arılar üzerindeki çeşitli diğer tedavileri test etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu nedenle, virüs enfeksiyonunu diğer faktörlerle ilişkilendiren deneyler için iyi bir temel oluşturabilir42.
Burada, arılar üzerindeki emeği ve mekanik stresi azaltan pupaları çıkarmak için bir yöntem ve viral enfeksiyon ve etkileri test etmek için oldukça tekrarlanabilir, yüksek verimli bir biyotahlil de dahil olmak üzere, pahalı bir ultrasantrifüj kullanmadan büyük miktarlarda yarı saf, yüksek oranda zenginleştirilmiş virüs parçacıkları üretmek için güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Viral inokulusun saflığını sıkı bir şekilde kontrol ederek, araştırmacılar bal arısı viral yanıtındaki varyasyonu diğer viral aşılama yöntemlerine göre azaltabilirler. Ayrıca, biyotahlil, viral etkileri, yönetilmesi çok daha emek yoğun olan alan gerçekçi ayarlara ölçeklendirmeden önce, yüksek oranda tekrarlanabilir deneysel birimler kullanarak küçük gruplar düzeyinde tarayabilir. Kombinasyon halinde, bu iki yöntem, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimleri hakkındaki genel anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olabilecek çalışmalar için gerekli araçları sağlar.

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Bal arıları dünya çapında büyük ekolojik ve tarımsal öneme sahiptir, ancak viral patojenlere maruz kalma da dahil olmak üzere arı sağlığını olumsuz yönde etkileyen çeşitli baskılara maruz kalmaktadır. Bu tür virüsler çok çeşitli yıkıcı etkilere neden olabilir ve deneysel tedavilerin etkilerini önceden var olan arka plan enfeksiyonundan ayırmayı zorlaştıran çoklu faktörler nedeniyle incelenmesi zor olabilir. Burada, viral enfeksiyonu ve etkileri test etmek için yüksek verimli bir biyotahlil ile birlikte büyük miktarlarda virüs parçacıklarını seri olarak üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli, virüssüz bir bal arısı hücre hattının mevcut eksikliğinin gerektirdiği viral parçacıklar, minimum stresli metodoloji kullanılarak kovandan büyük miktarlarda ekstrakte edilen bal arısı pupaları kullanılarak in vivo olarak çoğaltılır. Bu virüs parçacıkları daha sonra inoküla canlılığını test etmek için bal arısı kafesi biyotahlillerinde ve ayrıca beslenme, böcek ilaçları ve diğer patojenlerle etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli diğer virüs enfeksiyon dinamiklerinde kullanılabilir. Bu tür parçacıkları kullanmanın en büyük avantajı, enfekte arı hemolenfi veya homojenat yoluyla enfeksiyon gibi mevcut alternatiflerle karşılaştırıldığında, sonraki deneylerde bilinmeyen değişkenlerin ortaya çıkma şansını büyük ölçüde azaltmasıdır, ancak arıları tedarik ederken hala dikkatli olunmalıdır. Kafes tahlilleri, koloni düzeyinde virüs enfeksiyonu etkilerini test eden büyük ölçekli, saha gerçekçi deneylerin yerine geçmez, bunun yerine, yarı saf virüs parçacıkları ile kombinasyon halinde, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimlerinin çeşitli boyutlarını incelemek için önemli araçlar olarak hizmet edebilecek temel viral yanıtları oluşturmak için bir yöntem olarak işlev görür.

Pupa enjeksiyonu ve viral ekstraksiyon için protokolleri (Şekil 1) başarıyla takip etmek, büyük miktarlarda virüs parçacıkları üretmelidir. Bununla birlikte, çeşitli kolonilerden elde edilen pupaların birden fazla zaman noktasında örneklenmesi ve enjekte edilmesi, düşük kontaminasyonla hedef virüs edinme şansını en üst düzeye çıkarır. Virüslerin bir bal arısı içinde çoğaldıkları ve birbirleriyle etkileşime girdikleri dinamikler iyi anlaşılmamıştır; Önceden var o...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

preparation-virus-enriched-inoculum-for-oral-infection-honey-bees

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K Görüntüleme.  University of Illinois. Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Video: Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Nörobilim

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Çevre

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Koloni Düzeyde Bireysel olan Bal Arısı Kalkınma Çevre Kimyasalların Etkisinin Değerlendirilmesi

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Dokunsal İklimlendirme Ve Bal Arısı yılında antennal Örnekleme Stratejileri Hareket Analizi (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

Tek kohort Kolonileri ve İşçi arıların Hormon Tedavisi hazırlanması Rolü ve / veya Endokrin Sistemi Fizyolojisi İlişkili Analiz

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Ölçülü ve Serbest uçan Bal Arısı Nörofarmakolojik Manipülasyon,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

CRISPR-Cas9 kullanılarak Bal Arısı Beyin Bölümlerinde Anti-RDL ve Anti-mGlutR1 Reseptörleri Antikor Testi

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (Apis mellifera)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Koloni Düzeyde Bireysel olan Bal Arısı Kalkınma Çevre Kimyasalların Etkisinin Değerlendirilmesi

Dokunsal İklimlendirme Ve Bal Arısı yılında antennal Örnekleme Stratejileri Hareket Analizi (

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (

Yayılması

Tek kohort Kolonileri ve İşçi arıların Hormon Tedavisi hazırlanması Rolü ve / veya Endokrin Sistemi Fizyolojisi İlişkili Analiz

Ölçülü ve Serbest uçan Bal Arısı Nörofarmakolojik Manipülasyon,

CRISPR-Cas9 kullanılarak Bal Arısı Beyin Bölümlerinde Anti-RDL ve Anti-mGlutR1 Reseptörleri Antikor Testi

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon