Bu araştırma NIH 1R01HL140239-01 tarafından AMC'ye finanse edildi. Drexel Üniversitesi Hücre Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz.

1. Meme Epitel Hücre Büyümesi ve Assay Medya
<ol><li>MCF10A meme epitel hücreleri NOT: Tümörojenik olmayan ölümsüzleştirilmiş meme epitel hücre hattı fibrokistik hastalığı olan bir hastadan türetilmiştir43. Hücreler östrojen reseptörü ifade etmez.<ol>
<li>20 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) hazırlamak için, 200 μg/mL EGF yapmak için 500 μL steril dH2O'da 100 μg lyophilized EGF çözün. 20 μg/mL EGF stok çözeltisi yapmak için dH 2 O'da 4,5 mL steril%0,1 BSA'ya 500 μL 200 μg/mL EGF ekleyin. Mağaza 12 aya kadar -20 °C'de 20 μg/mL EGF aliquots hazırladı.</li>
		<li>500 μg/mL hidrokortizon hazırlamak için, 1 mg hidrokortizon 1 mL mutlak etanol (200 kanıt) seyreltin. 500 μg/mL hidrokortizon stok çözeltisi yapmak için bu karışıma 1 mL steril DMEM F:12 ekleyin. Hydrocortisone stok aliquots'u -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.</li>
		<li>10 μg/mL kolera toksini hazırlamak için, 1 mg/mL kolera toksin stok çözeltisi yapmak için 1 mg steril dH 2 O'da1mg kolera toksini lyophilized tozunu çözün. Kolera toksin stok aliquotlarını -80 °C'de 12 aya kadar saklayın.</li>
		<li>Growth Medium'u hazırlamak için 500 μL EGF (20 μg/mL), 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 20 ng/mL EGF'lik son konsantrasyon için 500 mL DMEM F:12'ye 25 mL at serumu, 500 ng/mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu. Biyobaskı işleminde sterilitenin azalmasını hesaba katmak için antibiyotik konsantrasyonu% 2'ye yükseltildi; bununla birlikte, antibiyotik konsantrasyonu% 1'e düşürülebilir.</li>
		<li>Assay Medium'u hazırlamak için 500 μL hidrokortizon (500 μg/mL), 5 μL kolera toksini (1 mg/mL), 500 μL sığır insülini (10 mg/mL), 10 mL penisilin ve streptomisin ekleyin, ve 500 mL hidrokortizon, 10 ng/mL kolera toksini, 10 ng/mL sığır insülini, %2 v/v penisilin ve streptomisin ve %5 v/v at serumu için 500 mL'ye 25 mL at serumu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOT: Üç negatif (östrojen reseptörü, progesteron reseptörü ve epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 eksikliği) meme kanseri epitel hücre hattı metastatik meme adenokarsinomlu bir kadın hastanın plevral efüzyonundan oluşturulur44. Hücreler agresif, invaziv ve kötü farklılaşmış bir meme kanserini temsil eder.<ol>
<li>Growth and Assay Medium'ı hazırlamak için 50 mL fetal sığır serumu, 10 mL penisilin ve streptomisine ve 500 mL DMEM'e 25 mL at serumu ekleyerek son konsantrasyon için %10 v/v fetal sığır serumu, %2 v/v penisilin ve streptomisinin ve %5 v/v at serumu ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Meme Epitel Hücre Kültürü
<ol><li>10 mL MCF10A veya MDA-MB-231 büyüme ortamına sahip 10 cm (P100) doku kültürü çanasında tohum 500.000 MCF10A veya MDA-MB-231 hücresi. MCF10A ve MDA-MB-231 hücreleri 48 saat içinde %90 birliğe ulaşır.</li>
	<li>Meme epitel hücrelerini geçirmek için, önce 10 mL sıcak PBS ile hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Meme epitel hücrelerini yemeğe %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Yemeği 20-25 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Trypsin nötralize hücrelerine 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 5 mL MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium'da yeniden ıslatın.</li>
	<li>MCF10A veya MDA-MB-231 Growth Medium ile birlikte 5 yeni 10 cm doku kültürü yemeklerinde 1 mL hücre süspansiyonu plakası. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreler 2-3 gün içinde tekrar geçişe hazır olacaktır. MCF10A hücreleri 35 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler. MDA-MB-231 hücreleri 24 numaralı geçişe kadar korunabilir, daha sonra morfolojik değişiklikler gösterirler.</li>
</ol>3. Meme Epitel Sferoid Oluşumu
<ol><li>Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (örneğin Matrigel) (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.</li>
	<li>Matrix çözeltisini polimerize etmek için 15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kuluçka odası slaytları.</li>
	<li>200.000 hücre/mL'de MCF10A Assay Medium'da yeniden 200.000 hücre/mL veya yeniden 200.000 hücre/mL'de MDA-MB-231 Growth Medium'da 1-MB-231 hücrelerini yeniden kullanılabilir.</li>
	<li>MCF10A hücrelerini kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisinin son konsantrasyonu için 5 mL Assay Medium'a 5 μL EGF (20 μg/mL) ve 100 μL matris çözeltisi ekleyerek taze MCF10A Küresel Büyüme Ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Matris çözeltisi ile önceden kaplanmış oda slaydını inkübatörden çıkarın. Her kuyuya 50 μL MCF10A veya MDA-MB-231 hücre süspansiyonu (10.000 hücre) ekleyin. MCF10A hücreleri kullanıyorsanız, 450 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin. MDA-MB-231 hücreleri kullanıyorsanız, %2 matris çözeltisi (9 μL) ile önceden karıştırılmış 450 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. Oda kaydıranı derhal 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı her 4 günde bir değiştirin. 200 μL pipet ucu kullanarak her kuyunun bir köşesinden dikkatlice pipet 200 μL eski ortam. Bu işlem sırasında, küresellerin bozulmamasını sağlamak için hazne kaydıranı 45 ° 'de eğin. 200 μL taze hazırlanmış MCF10A Küresel Büyüme Ortamı veya MDA-MB-231 Growth Medium daha önce% 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış, sferoidlerin matris tabakasına bağlı kalmasını sağlamak için damlalar halinde köşedeki her kuyuya ekleyin. Ortamın sadece ~ % 50'si değiştirilir, böylece küreseller tarafından üretilen tüm sitokinler tamamen tükenmez. NOT: MCF10A meme epitel sferoidlerinin polarize ve içi boş merkezler oluşturması 8 güne kadar sürer. MDA-MB-231 meme epitel sferoidlerinin oluşması 5 güne kadar sürer ve içi boş merkezleri yoktur.</li>
</ol>4. Endotel Hücre Ağı Oluşumu
<ol><li>İnsan Göbek Damarı Endotel Hücresi (HUVEC) Kültürü<ol>
<li>İnsülin büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü, vasküler endotel büyüme faktörü, askorbik asit, epidermal büyüme faktörü içeren tek bir Endotel Büyüme Orta-2 kitinin içeriğini ekleyin, heparin ve gentamisin-amfoterisin B, 50 mL fetal sığır serumu, 5 mL penisilin-streptomisin ve 5 mL 200 mM glutamin ila 500 mL Endotel Bazal Orta-2 (EBM-2) ile birlikte komple Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) oluşturur.</li>
		<li>10 mL EGM-2'de 10 cm doku kültürü çanasında 500.000 endotel hücresi tohumu. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatöre % 80 izdiliğe ulaşana kadar (yaklaşık 48 saat) yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri geçirmek için endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri faz kontrastı mikroskopisi ile yakından izleyin. Hücreler toplandığında hazırdır, ancak çanağa bağlı kalırlar.</li>
		<li>Trypsin'i dikkatlice yemekten çıkar. Yemeğe 8 mL EGM-2 ekleyin. EGM-2'yi tüm bulaşık yüzeyi üzerinde yukarı ve aşağı pipetle yıkayarak bulaşıktan hücreleri yıkayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, tripsin nötralize hücrelerine 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek ve hücre kümelerini parçalamak için hücre ortamı karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 3 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüje ekleyin. Süpernatantı dikkatlice emiş ve hücre peletini 10 mL EGM-2'de yeniden kullanın.</li>
		<li>10 cm'lik doku kültürü çanaklarına 9 mL EGM-2'ye 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Ortamın 2/3'ü her 2 günde bir taze EGM-2 ile değiştirin. Hücreler 3-5 gün içinde geçişe hazır olacaktır. HUVEC, 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endotel Hücresi (HUVEC) Ağ Oluşumu</li>
	<li>Teste başlamadan önce 200 μL pipet uçlarını 30 dakika dondurun. Büyüme faktörü azaltılmış matris çözeltisini (10 mg/mL) tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Yavaşça pipet 30 μL buz gibi matris çözeltisi, 8 kuyulu bir oda kaydırağının her kuyusuna buz gibi 200 μL pipet uçları kullanarak. Yanlardan başlayın ve pipet ucunu köşeler boyunca sürükleyin, her bir kuyunun eşit şekilde kaplanmasını sağlamak için kuyunun ortasına son bir damla ekleyerek. Düzgün bir matris çözelti katmanı sağlamak için bu adım sırasında hava kabarcıklarından kaçının. Her kuyu için yeni pipet ipuçları kullanın.</li>
	<li>Kuluçka odası Matrigel'i polimerize etmek için15-20 dakika boyunca 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde kayar.<ol>
<li>10 cm'lik bir HUVEC çanağa 10 μL kırmızı hücreli izleyici (1:1000) 37 °C'de 30 dakika, %5 CO2 inkübatör için önceden lekeleyin.</li>
		<li>Endotel hücrelerini 10 mL sıcak PBS ile yıkayın. HUVEC'i 10 cm'lik doku kültürü çanağını %0,05 Trypsin-EDTA'nın 2 mL'sini ekleyerek ayırın. Hücreleri tamamen ayırmak için kabı 5 dakika boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatöre yerleştirin.</li>
		<li>Tripsin nötralize etmek için yemeğe 5 mL EGM-2 ekleyin. Hücre süspansiyonu 25 mL konik bir tüpe aktarın. 5 dakika boyunca 1.200 x g'da Santrifüj HUVEC. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini serumsuz EBM-2'nin 5 mL'sinde yeniden boşaltın.</li>
		<li>Uygulanabilir hücreleri belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın. 1 x 106 hücre/mL çözümü oluşturun.</li>
		<li>200 μL serumsuz EBM-2 ile her kuyuya 100.000 HUVEC ekleyin. Daha fazla hücre eklenirse, tüp ağı yerine bir yüzey monolayer oluştururlar.</li>
		<li>HUVEC'i 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatır. 6 saat sonra, faz kontrastı mikroskopisi ile HUVEC ağlarını görüntüleyin. Ağlar artık meme sferoidleri ile coculture için hazır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Önceden oluşturulmuş HUVEC Ağlarında Meme epitel sferoidlerinin biyobaskı
NOT: Biyofabrikasyon işlemi için çift nozül biyo-biriktirme sistemi kullanılmalıdır. Bu durumda, sistem, malzeme birikiminin mikron ölçekli uzamsal kontrolüne izin vermek için üç hareket koluna ve 10 mL şırıngadan biyoink biriktirmek için iki vida tahrikli motora sahipti. Sistem, biyobaskı sırasında steril bir ortamı korumak için yüksek verimli partikül hava filtrasyon sisteminin yanı sıra UV sterilizasyon yetenekleri ile işlevselleştirilmelidir. Biyobaskı, baskı işleminden önce bir saat boyunca UV sterilize edilir.
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi meme epitel sferoidleri ve HUVEC ağları oluşturun. Temsili faz kontrastı mikroskopi görüntülerinde sferoidleri sayarak her kuyudaki meme epitel sferoidlerinin sayısını tahmin edin.</li>
	<li>1000 μL pipet ucunun ucundan 0,5 cm kesin. Kesilmiş pipet ucunu kullanarak tüm sferoidleri 8 kuyulu hazneli kaydıramadan 50 mL'lik bir tüpe dikkatlice pipetleyin. Seçilen biyoinkteki sferoidleri 100 sferoid/100 μL'de resuspend. NOT: Daha yüksek küresel konsantrasyonlar küresel kümelenme ile sonuçlanabilir ve küresel ağlar ile endotel ağları arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesini önleyebilir.</li>
	<li>Büyük veya kümelenmiş küreselleri çıkarmak için küresel karışımı 70 μm hücreli bir süzgeçten geçirin.</li>
	<li>Havuzalanmış sferoidleri 10 mL steril bir şırıngaya yükleyin ve 25 kalibrelik steril bir iğne ile kaplayın. Şırınnayı biyo-biriktirme sistemine takın.</li>
	<li>Ortamı 8 kuyulu oda kaydırağını HUVEC ağlarının dışına aspire edin.</li>
	<li>100 μL meme epitel sferoidlerini 1 mL/dk akış hızında 6 kuyu huvec ağlarına ekstrüde edin. Huvec ağlarının 2 kuyularını kontrol olarak koruyun.</li>
	<li>HUVEC ağlarında basılmış MCF10A küreselleri kullanıyorsanız 400 μL MCF10A Küresel Büyüme Ortamı ekleyin veya HUVEC ağlarında basılmış MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız daha önce % 2 matris çözeltisi ile karıştırılmış 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium ekleyin. huvec kontrol kuyularında ilgili küresel büyüme ortamı kullanılmalıdır.</li>
	<li>Medya değişikliği olmadan 24 - 96 saat boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde ortak kültürleri kuluçkaya yatırın. Ortak kültürler dört güne kadar orijinal ortamda canlı kalacak.</li>
</ol>6. Konfokal Mikroskopi
<ol><li>İmmünofluoresans ve PBS-Glisin Yıkama Tampon Hazırlama<ol>
<li>10x PBS'nin 500 mL'sinde 2,5 g sodyum azid, 5 g sığır serum albümini, 10 mL Triton X-100 ve 2,05 mL Ara-20 ekleyerek Immunofluorescence (IF) tampon 10x stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini bir yıla kadar 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x IF tamponu seyrelterek çalışan bir IF tamponu oluşturun. Çalışma sokmasını oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayın.</li>
		<li>10x PBS'nin 500 mL'sine 37,5 g glisin ekleyerek 10x PBS-Glisin tampon stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Tortulaşmayı önlemek için stok çözeltisini 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
		<li>450 mL steril deiyonize suda 50 mL 10x PBS-Glisin tamponunu seyrelterek çalışan bir PBS-Glisin çözeltisi oluşturun. Çalışma sokmasını 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konfokal Mikroskopi ile Etiket Biyobaskı Örnekleri ve Görüntü<ol>
<li>Biyobaskıda 3D ortak kültürlerden ortapirat yapın ve sıcak PBS ile 3 kez durulayın. Biyobaskıda 3D ortak kültürleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlayın. Örnekleri 1x PBS-Glisin ile 20 dakika boyunca 3 kez durulayın.</li>
		<li>IF tamponu ile 90 dakika boyunca %10 keçi serumu (birincil blok) karıştırılmış örnekleri bloke edin, ardından IF tamponu artı %10 keçi serumu ve Affinipure Fab parçası (1:100, ikincil blok) ile 40 dakika.</li>
		<li>MCF10A sferoidleri kullanıyorsanız, örnekleri 4 °C'de bir gecede ikincil blokaj tamponunda integrin α6 (1:100) için birincil antikor ile etiketle, ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında 1 saat boyunca Alexa Fluor 488 ikincil antikor (1:200) ve Hoescht 33342 (1:1000). MCF10A hücre hatları, küresel polarizasyon ve morfolojiyi göstermek için gerekli olan yüksek düzeyde integrin α6'yı ifade eder.</li>
		<li>Düşük integrin α6 seviyelerini ifade eden MDA-MB-231 sferoidleri kullanıyorsanız, numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 4 saat boyunca ikincil blokaj tamponunda Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) ve Hoescht 33342 (1:1000) ile etiketler. Phalloidin, aktüyon filament görselleştirmesini sağlar, böylece küresel amorf ve invaziv morfoloji değerlendirilebilir.</li>
		<li>Numuneleri 1X PBS glisin ile 3 kez 20 dakika yıkayın.</li>
		<li>Üreticinin aracını kullanarak hazne slaydını çıkararak numuneleri montaj için hazırlayın. Her kuyuya küçük bir damla antifade çözeltisi ekleyin. Her oda kaydırağının üzerine 22 mm x 60 mm'lik bir kapak kılıfı yerleştirin ve kenarları açık oje ile dikkatlice kapatın.</li>
		<li>5 μm adımda ~10 dilimden oluşan Z yığınları olarak konfokal mikroskop kullanan görüntü örnekleri. İsterseniz, hücre görüntüleme yazılımındaki Genişletilmiş Odak komutunu kullanarak Z düzlemlerini tek bir düzleme sıkıştırın.</li>
		<li>Görüntü J'yi kullanarak endotel ağlarına küresel yapışkanlığı ölçün. Yapışan küresellerin sayısı, uygun parçacık boyutuna ve daireselliğe sahip analiz eklentisi kullanılarak ölçülebilir. Görüntü alanına bağlı küresellerin sayısını normalleştirin.</li>
		<li>Tekrarlanabilirliği sağlamak için, ortak kültürlerin 4 x 4 karo görüntüsünde yapışan küresellerin sayısını ölçün. Küresel sayı istatistiksel olarak diğer deneylerden anlamlı olarak daha düşükse, deney tekrarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, 3D mimarilerinde de endotel hücreleriyle ortak kültür için 3D mimarilerinde sferoidleri biyobaskılamak için türünün ilk örneğidir. Kritik protokol adımları meme epitel sferoidlerinin ve HUVEC ağlarının ilk oluşumunu içerir. Meme epitel sferoidlerinin beslenmesinde çok dikkatli olunmalıdır, çünkü matris çözeltisinden kolayca bozulurlar. Benzer şekilde, meme epitel sferoidleri matris çözeltisi dışında pipetlendiğinde ve ağlara karıştırıldığında dikkatli bir şekilde ted...

3D in vitro vasküler tümör modelleri kanser büyümesi ve metastazının mekanistik çalışması için gerekli araçlardır. Özellikle meme kanseri için, Matrigel'de kültürlenen meme epitel hücreleri, in vivo meme acinus mimarisine daha yakından benzeyen polarize sferoidler halinde organize edilir1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D meme epitel hücre kültürü de hücre fonksiyonunu etkiler, 3D kültürler epidermal büyüme faktörü (EGF) reseptör modülasyonunda farklılıklar gösterir8,9; ErbB210dahil onkogen fonksiyonu; büyüme ve apoptoz sinyal11,12; ve kemoterapi direnci13,14. Vasküler endotel hücreleri benzer şekilde 3D ve geleneksel 2D kültür15 , 16 , 17,18'deçevresel uyaranlara farklı yanıt verir. Bununla birlikte, vasküler endotel ve meme epitel etkileşimlerinin anlaşılmasının çoğu, şartlandırılmış orta veya Transwell kesici uçlar kullanılarak 2D kültüründen veya iki hücre tipinin fiziksel olarak ayrıldığı 3D modellerden gelir19,20,21,22,23. Bu ortak kültür modelleri sınırlı fizyolojik içgörü sağlar, çünkü hem 3D kültür hem de hücre-hücre teması vasküler endotel için kritik öneme sahiptir - meme epitel hücre etkileşimleri24,25,26.
3D kanser modelleri, hidrojellerde veya mühendislik iskelelerinde asılı damla küresel oluşumu, biyobaskı, manyetik montaj ve kültür dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak üretilmiştir5,27,28,29. Daha yakın zamanda, kendi 3D yapılarında düzenlenmiş birden fazla hücre tipi ile 3D tümör modelleri oluşturulmuştur. Çip üzerindeki tümör platformunun bir örneğinde, kanser, endotel ve stromal hücreler bir matrise karıştırıldı ve daha sonra polidimetilsiloksiksan (PDMS) cihazındaki üç merkezi doku odasına enjekte edildi. Doku odaları, arter ve venule'yi temsil eden iki dış kanalla sınırlandı. 5-7 günlük kültürden sonra endotel hücreleri bir mikrovasküler ağ oluşturdu ve kanser hücreleri çoğalarak vaskülatın yakınında küçük tümörler oluşturdu. Bu platform daha sonra uyuşturucu ve ilaç kombinasyonlarını taramak için kullanıldı30. Belirli mekanik uyaranlara (örneğin, akciğerdeki mekanik zorlanma) sahip metastaz ve kanser türlerini incelemek için ek çip üzerinde tümör platformları oluşturulmuştur31,32. Bununla birlikte, bu platformlar genellikle ilgili 3D yapılarında hem vaskülat hem de kanser içermez.
Biyofabrikasyon, hücre konumu üzerinde sıkı mekansal kontrol sağladığından, 3D in vitro vasküler tümör modellerinin ilerletmesinde büyük umut vaat ediyor. Son on yılda biyobaskı büyümesine rağmen, çok az çalışma özellikle tümörlere odaklanmaktadır33,34. Bir örnekte, in vitro serviks kanseri modeli oluşturmak için hela hücrelerinin jelatin/aljinat/fibrinojen hidrojelde 3D baskısı kullanılmıştır. Tümör hücreleri tek tek hücreler olarak biyobaskı yapıldı ve daha sonra daha yüksek çoğalma oranı, matris metalloproteinaz ekspresyözü ve 2D kültürdeki hücrelerden daha yüksek chemoresistance gösteren küreseller oluşturmasına izin verildi35. Bu çalışmalarda, diğerlerinde olduğu gibi36,37, ayrışmış hücre süspansiyonları biyobaskı verildi ve daha sonra hücre kültürlerine hücrelerin 3D bir yapı oluşturmasını sağlamak için gerekli mekanik ve biyokimyasal ipuçları sağlandı. Bununla birlikte, hücresel kendi kendine montaj günler veya haftalar sürebilir, karmaşık uzamsal ve zamansal çevresel ipuçları gerektirebilir veya iki hücre tipi birlikte kültürlendiğinde gerçekleşmeyebilir. Örneğin, meme epitel hücreleri 2D ortak kültürde endotel hücrelerinde hücre ölümüne neden oldu ve ayrışmış meme epitel hücreleri aljinat / jelatin hidrojellerinde biyobaskılandığında 3D sferoidler oluşturmadı38. Dissosiyatif meme epitel veya kanser hücreleri aljinat bazlı biyoinkslerde sadece dairesel PDMS kalıplarına yakalandığında sferoidler oluşturdu. Diğer durumlarda, sferoidler ultra düşük bağlanma dairesel kuyu plakalarında askıya alınmış damlacıklar kullanılarak oluşturulmuş ve daha sonra aljinat bazlı biyoinks39,40' a karıştırılmıştır.
Şimdi bu protokolde alternatif bir 3D doku biyomüslüm yöntemini tarif ediyoruz. Tohum ayrışmış hücreler yerine ve bu hücrelerin 3D yapıları oluşturmasını beklemek yerine, hemen kullanılabilecek bir tümör ortak kültür modeli oluşturmak için vasküler bir tüp ağında 3D tümör sferoidlerinin nasıl oluşturulacağını ve biyobaskı yapılacağını açıklıyoruz. Tümör sferoidleri in vitro olarak yetiştirilebilir veya insan dokularından (organoidler) türetilebilir. Benzer şekilde, vasküler tüpler yetiştirilebilir veya yağ dokusu mikrovasküler parçalarından elde edilebilir. Biyoinksler biyolojik olarak aktif olmayan aljinattan son derece biyolojik olarak aktif Matrigel41'ekadar değişebilir. Bu 3D tümör ortak kültür modeli çeşitli hücre yapıları ve biyoinks ile oluşturulabildiğinden, birden fazla hücre tipi, hücre dışı matrisler ve kemokin gradyanları15,42. Mevcut formülasyonunda, endotel ağları perfüzyona maruz kalamasa da, gelecekteki yinelemeler bu yöntemi mikrofluidler veya yonga üzerindeki sistemlerle entegre edebilir. Endotel ağlarına biyobaskı 3D meme epitel sferoidleri, ilaç testi ve kişiselleştirilmiş hassas tıp için insan meme modellerinin hızlı biyofabrikasyonuna olanak sağlar27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Biyobaskı, in vivo doku mimarisinin kritik özelliklerini daha iyi yeniden toplayan 3D insan kanseri modelleri imal etmek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkıyor. Mevcut katman katman ekstrüzyon biyobaskısında, tek tek hücreler hiyerarşik doku kendini birleştirmeyi teşvik etmek için karmaşık mekansal ve zamansal ipuçları ile birlikte bir biyoinkte ekstrüde edilir. Bununla birlikte, bu biyofabrikasyon tekniği hücreler, biyoinksler ve biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimlere dayanır. Bu nedenle, kendi kendine montaj günler hatta haftalar sürebilir, belirli biyoinksler gerektirebilir ve her zaman birden fazla hücre tipi söz konusu olduğunda ortaya çıkmayabilir. Bu nedenle, çeşitli biyoinkslerde önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidlerini doğrudan biyobaskılamak için bir teknik geliştirdik. Biyobaskı önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidleri baskıdan sonra canlılıklarını ve polarize mimarilerini sürdürdüler. Ayrıca 3D sferoidleri vasküler endotel hücre ağlarına yazdırarak ortak kültür modeli oluşturduk. Böylece, yeni biyobaskı tekniği hızla daha düşük maliyetle ve geleneksel biyobaskı tekniklerinden daha yüksek esneklikle daha fizyolojik olarak ilgili bir 3D insan meme modeli oluşturur. Bu çok yönlü biyobaskı tekniği, ek biyoinkslerde diğer dokuların 3D modellerini oluşturmak için tahmin edilebilir.

Meme epitel hücreleri matris çözeltisi üzerinde 5-8 günlük kültürden sonra ve % 2 matris çözeltisi ile kültür ortamında 3D sferoidler halinde kendi kendine organize edilmelidir. Tümörijenik olmayan MCF10A meme epitel sferoidleri yuvarlak görünmeli ve entegre α6 sferoidin dış kenarına polarize edilmiş içi boş bir merkeze sahip olmalıdır(Şekil 1, inset içi içi boş merkezleri gösterir). Son derece invaziv MDA-MB-231 meme kanseri epitel hücreleri düzensiz sferoid...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K Görüntüleme.  Drexel University. Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.

Video: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Biyomühendislik

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Jelatin Metacryloyl Hidrojel Bazlı Bioinks 3D Biyobaskı Protokolleri

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

ECM Sertleşmesine Hücresel Tepkileri Araştırmak için Fototize Edilebilir Biyobaskılı Hidrojeller

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

Yazar Spotlight: 3D Baskılı Fototable Hidrojeller Kullanarak Kronik Akciğer Hastalıklarını Anlamak 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...