Questa ricerca è stata finanziata da NIH 1R01HL140239-01 ad AMC. Ringraziamo il Cell Imaging Center della Drexel University.

1. Crescita delle cellule epiteliali del seno e mezzi di dosaggio
<ol><li>Cellule epiteliali del seno MCF10A NOTA: La linea cellulare epiteliale del seno immortalato non tumorigenica è derivata da un paziente con malattia fibrocistica43. Le cellule non esprimono il recettore degli estrogeni.<ol>
<li>Per preparare 20 μg/mL di fattore di crescita epidermico (FEG), sciogliere 100 μg di FEG liofilizzato in 500 μL di dHsterile 2O per fare 200 μg/mL FEG. Aggiungere 500 μL di 200 μg/mL FEG in 4,5 mL di BSA sterile 0,1% in dH2O per fare una soluzione stock EGF da 20 μg/mL. Conservare le aliquote EGF da 20 μg/mL preparate a -20 °C per un massimo di 12 mesi.</li>
		<li>Per preparare 500 μg/mL idrocortisone, diluire 1 mg di idrocortisone in 1 mL di etanolo assoluto (dimostrazione 200). Aggiungere 1 mL di DMEM F:12 sterile a questa miscela per fare una soluzione di stock di idrocortisone da 500 μg/mL. Conservare le aliquote di stock di idrocortisone a -80 °C per un massimo di 12 mesi.</li>
		<li>Per preparare una tossina colera da 10 μg/mL, sciogliere 1 mg di polvere liofilizzata di tossine colera in 1 mL di dH2O sterile per fare una soluzione di 1 mg/mL di stock di tossine colera. Conservare le aliquote delle scorte di tossina colera a -80 °C per un massimo di 12 mesi.</li>
		<li>Per preparare il terreno di crescita, aggiungere 500 μL di EGF (20 μg/mL), 500 μL di idrocortisone (500 μg/mL), 5 μL di tossina colera (1 mg/mL), 500 μL di insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL di penicillina e streptomicina, e da 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM F:12 per una concentrazione finale di 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL idrocortisone, 10 ng/mL tossina colera, 10 ng/mL di insulina bovina, 2% di penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v. La concentrazione di antibiotici è stata aumentata al 2% per tenere conto della diminuzione della sterilità nel processo di biostamgrafia; tuttavia, la concentrazione di antibiotici può essere abbassata all'1%.</li>
		<li>Per preparare il mezzo di dosaggio, aggiungere 500 μL di idrocortisone (500 μg/mL), 5 μL di tossina colera (1 mg/mL), 500 μL di insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL di penicillina e streptomicina, e da 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM F:12 per una concentrazione finale di idrocortisone da 500 ng/mL, tossina colera 10 ng/mL, insulina bovina 10 ng/mL, 2% v/v penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOTA: La linea cellulare epiteliale del cancro al seno tripla-negativa (priva di recettore degli estrogeni, recettore del progesterone e recettore del fattore di crescita epidermico 2) è creata dall'effusione pleurica di una paziente con adenocarcinoma mammario metastatico44. Le cellule rappresentano un cancro al seno aggressivo, invasivo e scarsamente differenziato.<ol>
<li>Per preparare il terreno di crescita e di dosaggio, aggiungere 50 mL di siero bovino fetale, 10 mL di penicillina e streptomicina e 25 mL di siero di cavallo a 500 mL di DMEM per una concentrazione finale 10% v/v siero bovino fetale, 2% v/v penicillina e streptomicina e siero di cavallo 5% v/v.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coltura cellulare epiteliale del seno
<ol><li>Semina 500.000 cellule MCF10A o MDA-MB-231 in un piatto di coltura tissutale da 10 cm (P100) con 10 mL di supporti di crescita MCF10A o MDA-MB-231. Le celle MCF10A e MDA-MB-231 raggiungono la confluenza del 90% in 48 ore.</li>
	<li>Per passare le cellule epiteliali del seno, lavare prima le cellule con 10 mL di PBS caldo.</li>
	<li>Staccare le cellule epiteliali del seno aggiungendo 2 mL dello 0,05% di tripina-EDTA al piatto. Mettere il piatto in un incubatore di CO2 da 37 °C per 20-25 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium alle celle tripsinziate per neutralizzare la tripina. Pipettare la miscela cella-supporto su e giù per rimospendare le cellule e rompere i cluster di celle.</li>
	<li>Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium.</li>
	<li>Piatto 1 mL di sospensione cellulare in 5 nuovi piatti di coltura tissutale da 10 cm insieme a MCF10A o MDA-MB-231 Growth Medium. Posizionare i piatti in un incubatore di CO 2 a 37 °C,5%. Le cellule saranno pronte per essere di nuovo passaggio in 2-3 giorni. Le cellule MCF10A possono essere mantenute al passaggio numero 35, dopo di che mostrano cambiamenti morfologici. Le cellule MDA-MB-231 possono essere mantenute al passaggio numero 24, dopo di che mostrano cambiamenti morfologici.</li>
</ol>3. Formazione epiteliale dello sferoide del seno
<ol><li>Congelare le punte della pipetta da 200 μL per 30 minuti prima di iniziare il saggio. Mantenere la soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita (ad esempio Matrigel) (10 mg/mL) sul ghiaccio per l'intero processo.</li>
	<li>Pipettare lentamente 30 μL di soluzione a matrice ghiacciata utilizzando punte di pipetta ghiacciate da 200 μL in ogni pozzo di uno scivolo a camera da 8 pozzi. Iniziare dai lati e trascinare la punta della pipetta lungo gli angoli, aggiungendo una goccia finale al centro del pozzo per garantire un rivestimento uniforme di ogni pozzo. Evitare bolle d'aria durante questo passaggio per garantire uno strato di soluzione a matrice uniforme. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare i vetrini della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C per 15-20 minuti per polimerizzare la soluzione matriciale.</li>
	<li>Cellule MCF10A risuspend tripsinziate in MCF10A Assay Medium a 200.000 celle/mL o cellule MDA-MB-231 risospese in MDA-MB-231 Growth Medium a 200.000 celle/mL.</li>
	<li>Se si utilizzano cellule MCF10A, preparare un mezzo di crescita sferoide MCF10A fresco aggiungendo 5 μL di EGF (20 μg/mL) e 100 μL di soluzione matriciale a 5 mL di mezzo di dosaggio per una concentrazione finale di soluzione a matrice del 2%.</li>
	<li>Rimuovere lo scivolo della camera prerivestito con soluzione a matrice dall'incubatore. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare MCF10A o MDA-MB-231 (10.000 celle) a ciascun pozzo. Se si utilizzano cellule MCF10A, aggiungere 450 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium. Se si utilizzano celle MDA-MB-231, aggiungere 450 μL di MDA-MB-231 Growth Medium premiscelato con soluzione a matrice del 2% (9 μL). Posizionare immediatamente lo scivolo della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C, al 5%.</li>
	<li>Sostituire il mezzo ogni 4 quattro giorni. Pipettare con cura 200 μL di vecchi supporti da un angolo di ciascun pozzo utilizzando una punta di pipetta da 200 μL. Durante questo processo, inclinare lo scivolo della camera a 45° per assicurarsi che gli sferoidi non siano disturbati. Aggiungere 200 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium appena preparato o MDA-MB-231 Growth Medium precedentemente miscelato con soluzione a matrice del 2% ad ogni pozzo all'angolo in gocce per garantire che gli sferoidi rimangano attaccati allo strato della matrice. Solo circa il 50% del supporto viene sostituito in modo che tutte le citochine prodotte dagli sferoidi non siano completamente esaurite. NOTA: Gli sferoidi epiteliali del seno MCF10A ci tano fino a 8 giorni per polarizzare e formare centri cavi. Gli sferoidi epiteliali del seno MDA-MB-231 richiedere fino a 5 giorni per formarsi e non hanno centri cavi.</li>
</ol>4. Formazione della rete cellulare endoteliale
<ol><li>Cultura della cellula endoteliale della vena ombelicale umana (HUVEC)<ol>
<li>Aggiungere il contenuto di un singolo kit di crescita endoteliale medium-2 contenente fattore di crescita dell'insulina, fattore di crescita dei fibroblasti, fattore di crescita endoteliale vascolare, acido ascorbico, fattore di crescita epidermico, eparina e gentamicina-ampotericina B, insieme a 50 mL di siero bovino fetale, 5 mL penicillina-streptomicina e 5 mL di glutammina da 200 mM a 500 mL di Basale Medio-2 Endoteliale (EBM-2) per creare un mezzo di crescita endoteliale completo (EGM-2).</li>
		<li>Semina 500.000 cellule endoteliali in un piatto di coltura tissutale di 10 cm in 10 mL di EGM-2. Posizionare le cellule in un incubatore di CO2 da 37 °C, 5% fino a raggiungere la confluenza >80% (circa 48 ore).</li>
		<li>Per passare le cellule, lavare le cellule endoteliali con 10 mL di PBS caldo. Staccare HUVEC aggiungendo 2 mL dello 0,05% di Tripina-EDTA al piatto di coltura tissutale da 10 cm. Monitorare da vicino le cellule mediante microscopia a contrasto di fase. Le cellule sono pronte quando vengono ballate verso l'alto ma rimangono attaccate al piatto.</li>
		<li>Aspirare con cura la triptina dal piatto. Aggiungere 8 mL di EGM-2 al piatto. Lavare le celle dal piatto pipettando l'EGM-2 su e giù su tutta la superficie del piatto.</li>
		<li>In alternativa, aggiungere 5 mL di EGM-2 alle cellule tripsinziate per neutralizzare la tripside. Pipettare la miscela cella-supporto su e giù per rimospendare le cellule e rompere i cluster di celle. Aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 mL di EGM-2.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a 9 mL di EGM-2 in un piatto di coltura tissutale da 10 cm. Posizionare i piatti in un incubatore di CO 2 a 37 °C,5%. Scambia 2/3 del mezzo con EGM-2 fresco ogni 2 giorni. Le cellule saranno pronte per il passaggio in 3-5 giorni. HUVEC può essere mantenuto fino al passaggio 8 dopo di che non riescono a formare reti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formazione di rete huvec (Endothelial Cell)</li>
	<li>Congelare le punte della pipetta da 200 μL per 30 minuti prima di iniziare il saggio. Mantenere la soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita (10 mg/mL) sul ghiaccio per l'intero processo.</li>
	<li>Pipettare lentamente 30 μL di soluzione a matrice ghiacciata utilizzando punte di pipetta ghiacciate da 200 μL in ogni pozzo di uno scivolo a camera da 8 pozzi. Iniziare dai lati e trascinare la punta della pipetta lungo gli angoli, aggiungendo una goccia finale al centro del pozzo per garantire un rivestimento uniforme di ogni pozzo. Evitare bolle d'aria durante questo passaggio per garantire uno strato di soluzione a matrice uniforme. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni pozzo.</li>
	<li>Incubare gli scivoli della camera in un incubatore di CO2 a 37 °C per 15-20 minuti per polimerizzare Matrigel.<ol>
<li>Pre-macchiare un piatto di 10 cm di HUVEC con 10 μL di tracker di globuli rossi (1:1000) per 30 minuti in 37 °C, 5% di incubatrice di CO2.</li>
		<li>Lavare le cellule endoteliali con 10 mL di PBS caldo. Staccare HUVEC aggiungendo 2 mL dello 0,05% di Tripina-EDTA al piatto di coltura tissutale da 10 cm. Mettere il piatto in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 5 minuti per staccare completamente le cellule.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di EGM-2 al piatto per neutralizzare la tripina. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo conico da 25 ml. Centrifuga HUVEC a 1.200 x g per 5 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 5 mL di EBM-2 senza siero.</li>
		<li>Contare le celle usando Trypan blue per determinare le celle vitali. Creare una soluzione a 1 x10 6 celle/mL.</li>
		<li>Aggiungere 100.000 HUVEC ad ogni pozzo con 200 μL di EBM-2 senza siero. Se vengono aggiunte più celle, creeranno un monostrato di superficie piuttosto che una rete di tubi.</li>
		<li>Incubare HUVEC in un incubatore di 37 °C, 5% CO2. Dopo 6 ore, immagine reti HUVEC per microscopia a contrasto di fase. Le reti sono ora pronte per la cocultura con sferoidi del seno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Biostampa Sferoidi epiteliali del seno su reti HUVEC pre-formate
NOTA: Per il processo di biofabbricazione deve essere utilizzato un sistema di biodeposizione a doppio ugello. In questo caso, il sistema aveva tre bracci di movimento per consentire il controllo spaziale su scala micron della deposizione del materiale e due motori azionati a vite per depositare bioink da siringhe da 10 ml. Il sistema deve essere funzionalizzato con un sistema di filtrazione dell'aria di particolato ad alta efficienza e capacità di sterilizzazione UV per mantenere un ambiente sterile durante la biostampa. Il biostampatore viene sterilizzato ai raggi UV per un'ora prima del processo di stampa.
<ol><li>Creare sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC come descritto in precedenza. Stimare il numero di sferoidi epiteliali del seno in ogni pozzo contando gli sferoidi nelle immagini rappresentative della microscopia a contrasto di fase.</li>
	<li>Tagliare 0,5 cm dall'estremità di una punta della pipetta da 1000 μL. Utilizzare la punta della pipetta tagliata per pipettare con cura tutti gli sferoidi fuori dal vetrino da camera a 8 pozza e in un tubo da 50 ml. Sferoidi resuspendi nel bioink selezionato a 100 sferoidi/100 μL. NOTA: Concentrazioni più elevate di sferoidi possono causare il clustering degli sferoidi e impedire la visualizzazione delle interazioni tra gli sferoidi e le reti endoteliali.</li>
	<li>Passare la miscela di sferoidi attraverso un colino cellulare da 70 μm per rimuovere eventuali sferoidi grandi o raggruppati.</li>
	<li>Caricare gli sferoidi raggruppati in una siringa sterile da 10 ml e cappuccio con un ago sterile calibro 25. Attaccare la siringa al sistema di bio-deposizione.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dalle reti HUVEC nello scivolo da camera a 8 pozzi.</li>
	<li>Estrudere 100 μL di sferoidi epiteliali del seno su 6 pozzi di reti HUVEC ad una portata di 1 mL/min. Mantenere 2 pozzi di reti HUVEC come controlli.</li>
	<li>Aggiungere 400 μL di MCF10A Spheroid Growth Medium se si utilizzano sferoidi MCF10A stampati su reti HUVEC o aggiungere 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium precedentemente miscelato con soluzione a matrice del 2% se si utilizzano sferoidi MDA-MB-231 stampati su reti HUVEC. Il rispettivo mezzo di crescita dello sferoide deve essere utilizzato nei pozzi di controllo HUVEC.</li>
	<li>Incubare le co-colture in un incubatore di CO2 a 37 °C, 5% per 24 - 96 ore senza un cambiamento mediatico. Le co-culture rimarranno vitali nel mezzo originale per un massimo di quattro giorni.</li>
</ol>6. Microscopia confocale
<ol><li>Immunofluorescenza e preparazione tampone lavaggio PBS-glicina<ol>
<li>Preparare la soluzione tampone di immunofluorescenza (IF) 10x aggiungendo 2,5 g di azide di sodio, 5 g di albumina di siero bovino, 10 mL di Tritone X-100 e 2,05 mL di Tween-20 in 500 mL di 10x PBS. Regolare il pH a 7,4. Conservare la soluzione stock fino a un anno a 4 °C per evitare la sedimentazione.</li>
		<li>Creare un tampone IF funzionante diluire 50 mL di tampone IF 10x in 450 mL di acqua deionizzata sterile. Conservare la soluzione di lavoro a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.</li>
		<li>Preparare 10x soluzione di scorta tampone PBS-Glicina aggiungendo 37,5 g di glicina a 500 mL di 10x PBS. Regolare il pH a 7,4. Conservare la soluzione stock fino a 6 mesi a 4 °C per evitare la sedimentazione.</li>
		<li>Creare una soluzione pbs-glicina funzionante diluire 50 mL di tampone PBS-Glicina 10x in 450 mL di acqua deionizzata sterile. Conservare la soluzione di lavoro a 4 °C per un massimo di una settimana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etichetta campioni biostampati e immagine per microscopia confocale<ol>
<li>Aspirare il mezzo dalle co-colture 3D biostampate e risciacquare 3 volte con PBS caldo. Fissare co-colture 3D biostampate con paraformaldeide al 4% per 1 h a temperatura ambiente. Risciacquare i campioni 3 volte per 20 minuti con 1 pbs-glicina.</li>
		<li>Blocca i campioni con tampone IF mescolato con il 10% di siero di capra per 90 minuti (blocco primario), seguito da 40 minuti con buffer IF più il 10% di siero di capra e frammento affinipure fab (1:100, blocco secondario).</li>
		<li>Se si utilizzano sferoidi MCF10A, etichettare campioni con un anticorpo primario per l'integrina α6 (1:100) in tampone di blocco secondario durante la notte a 4 °C, seguiti da un anticorpo secondario Alexa Fluor 488 (1:200) e Hoescht 33342 (1:1000) per 1 h a temperatura ambiente protetto dalla luce. Le linee cellulari MCF10A esprimono alti livelli di integrina α6, che è essenziale per mostrare polarizzazione e morfologia dello sferoide.</li>
		<li>Se si utilizzano sferoidi MDA-MB-231, che esprimono bassi livelli di integrina α6, etichettare i campioni con Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) e Hoescht 33342 (1:1000) nel buffer di blocco secondario per 4 ore a temperatura ambiente protetta dalla luce. La phalloidina consente la visualizzazione del filamento di actina in modo da poter valutare la morfologia amorfa e invasiva dello sferoide.</li>
		<li>Lavare i campioni con 1X PBS-glicina 3 volte per 20 minuti.</li>
		<li>Preparare i campioni per il montaggio rimuovendo lo scivolo della camera utilizzando lo strumento del produttore. Aggiungere una piccola goccia di soluzione antifade ad ogni pozzo. Posizionare un coverslip da 22 mm x 60 mm su ogni scivolo della camera e sigillare accuratamente i bordi con smalto chiaro.</li>
		<li>Campioni di immagini che utilizzano un microscopio confocale come pile Z di ~10 fette in passaggi da 5 μm. Se lo si desidera, comprimere i piani Z in un singolo piano utilizzando il comando Messa a fuoco estesa nel software di imaging cellulare.</li>
		<li>Quantificare l'adesione dello sferoide alle reti endoteliali usando Image J. Il numero di sferoidi aderenti può essere quantificato utilizzando il plugin di analisi con la dimensione e la circolarità delle particelle appropriate. Normalizzare il numero di sferoidi collegati all'area dell'immagine.</li>
		<li>Per garantire la riproducibilità, quantificare il numero di sferoidi aderenti in 4 x 4 immagini piastrellate di co-culture. Se il numero di sferoidi è statisticamente significativamente inferiore rispetto ad altri esperimenti, l'esperimento deve essere ripetuto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è il primo del suo genere a biostampare sferoidi nella loro architettura 3D per la co-coltura con cellule endoteliali anche nella loro architettura 3D. I passaggi critici del protocollo includono la formazione iniziale di sferoidi epiteliali del seno e reti HUVEC. Estrema cautela deve essere presa nell'alimentazione degli sferoidi epiteliali del seno, in quanto sono facilmente interrotti dalla soluzione matriciale. Allo stesso modo, gli sferoidi epiteliali del seno devono essere trattati con cura quand...

I modelli tumorali vascolarizzati in vitro 3D sono strumenti essenziali per lo studio meccanicistico della crescita e della metastasi del cancro. Per il cancro al seno in particolare, le cellule epiteliali del seno coltivate a Matrigel si organizzano in sferoidi polarizzati che assomigliano più da vicino all'architettura in vivo dell'acinomammario 1,2,3,4,5,6,7,8. La coltura cellulare epiteliale del seno 3D influisce anche sulla funzione cellulare, con colture 3D che mostrano differenze nella modulazione del recettore del fattore di crescita epidermica (EGF)8,9; funzione oncogene, compreso ErbB210; crescita e apoptosi segnalando11,12; e resistenza allachemioterapia 13,14. Le cellule endoteliali vascolari rispondono in modo diverso agli stimoli ambientali in 3D rispetto alla coltura 2Dtradizionale 15,16,17,18. Tuttavia, gran parte della comprensione delle interazioni endoteliali vascolari e epiteliali del seno proviene da coltura 2D utilizzando inserti condizionati di mezzo o Transwell, o modelli 3D in cui i due tipi di cellule sono fisicamenteseparati 19,20,21,22,23. Questi modelli di co-coltura forniscono una visione fisiologica limitata, poiché sia la coltura 3D che il contatto cellulare-cellulare sono fondamentali per le interazioni endoteliali vascolari - cellule epiteliali del seno24,25,26.
I modelli di cancro 3D sono stati fabbricati utilizzando una varietà di tecniche, tra cui la formazione di sferoidi a goccia appesa, la biostamce, l'assemblaggio magnetico e la coltura all'interno di idrogel osu impalcature ingegnerizzate 5,27,28,29. Più recentemente, i modelli di tumore 3D sono stati creati con più tipi di cellule disposte nelle rispettive strutture 3D. In un esempio di piattaforma tumorale su chip, il cancro, le cellule endoteliali e stromali sono state mescolate in una matrice e quindi iniettate nelle tre camere del tessuto centrale in un dispositivo polidimetilossano (PDMS). Le camere tissutali erano delimitate da due canali esterni che rappresentavano un'arteria e una venula. Dopo 5-7 giorni di coltura, le cellule endoteliali formarono una rete microvascolare e le cellule tumorali proliferarono per formare piccoli tumori vicino alla vascolarizzazione. Questa piattaforma è stata quindi utilizzata per migliorare le combinazioni di farmacie farmaci 30. Ulteriori piattaforme tumorali su chip sono state create per studiare metastasi e tipi di cancro con stimoli meccanici specifici (ad esempio, ceppo meccanico nel polmone)31,32. Tuttavia, queste piattaforme generalmente non includono sia la vascucolatura che il cancro nelle rispettive strutture 3D.
La biofabbricazione mostra grandi promesse nell'avanzamento dei modelli di tumore vascolarizzato 3D in vitro, poiché consente uno stretto controllo spaziale sulla posizione delle cellule. Nonostante la crescita della biostampa nell'ultimo decennio, pochi studi si concentrano specificamente sui tumori33,34. In un esempio, la stampa 3D di cellule HeLa in un idrogel gelatinoso/alginato/fibrinogeno è stata utilizzata per creare un modello di cancro cervicale in vitro. Le cellule tumorali sono state biostampate come singole cellule e quindi hanno permesso di formare sferoidi, che hanno mostrato un più alto tasso di proliferazione, un aumento dell'espressione metalloproteinasi della matrice e una maggiore chemioresistenza rispetto alle cellule nella coltura 2D35. In questi studi, come in molti altri36,37, le sospensioni cellulari dissociate sono state biostampate, e poi alle colture cellulari sono stati forniti i segnali meccanici e biochimici necessari per consentire alle cellule di formare una struttura 3D. Tuttavia, l'auto-assemblaggio cellulare può richiedere giorni o settimane, può richiedere segnali ambientali spaziali e temporali complessi o non può verificarsi quando due tipi di cellule sono co-coltivati. Ad esempio, le cellule epiteliali del seno hanno indotto la morte cellulare nelle cellule endoteliali in co-coltura 2D e le cellule epiteliali del seno dissociate non hanno formato sferoidi 3D quando biostampate in idrogel di alginato / gelatina38. Le cellule epiteliali o tumorali del seno dissociate formavano sferoidi in bioinchiostri a base di alginato solo quando intrappolati in stampi PDMS circolari. In altri casi, gli sferoidi sono stati formati utilizzando goccioline sospese in piastre circolari ad attacco ultra-basso e quindi mescolati in bioinchiostri a base di alginato39,40.
In questo protocollo descriviamo ora un metodo alternativo di biofabbricazione dei tessuti 3D. Piuttosto che seminare cellule dissociate e aspettare che queste cellule formino le strutture 3D, descriviamo come creare e biostampare sferoidi tumorali 3D su una rete di tubi vascolari per creare un modello di co-coltura tumorale che può essere utilizzato quasi immediatamente. Gli sferoidi tumorali possono essere coltivati in vitro o derivati da tessuti umani (organoidi). Allo stesso modo, i tubi vascolari possono essere coltivati o possono essere derivati da frammenti microvascolari del tessuto adiposo. I bioinchiaci possono variare dall'alginato biologicamente inattivo al Matrigel41 altamente biologicamente attivo. Poiché questo modello di co-coltura tumorale 3D può essere creato con una varietà di strutture cellulari e bioinchiostri, può incorporare più tipi di cellule, matrici extracellulari e gradienti di chemiochina15,42. Mentre nella sua formulazione attuale, le reti endoteliali non possono essere perfuse, le iterazioni future potrebbero integrare questo metodo con microfluidi o sistemi -on-chip. La biostampa di sferoidi epiteliali del seno 3D su reti endoteliali consente una rapida biofabbricazione dei modelli mammari umani per il test dei farmaci e la medicina diprecisione personalizzata 27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

La biostampa sta emergendo come uno strumento promettente per fabbricare modelli di cancro umano 3D che ricapitolano meglio i tratti distintivi critici dell'architettura tissutale in vivo. Nell'attuale biostamma di estrusione strato per strato, le singole cellule vengono estruse in un bioink insieme a complessi segnali spaziali e temporali per promuovere l'auto-assemblaggio gerarchico dei tessuti. Tuttavia, questa tecnica di biofabbricazione si basa su interazioni complesse tra cellule, bioinchiostri e segnali biochimici e biofisici. Pertanto, l'auto-assemblaggio può richiedere giorni o addirittura settimane, può richiedere bioinchiostri specifici e potrebbe non verificarsi sempre quando è coinvolto più di un tipo di cellula. Abbiamo quindi sviluppato una tecnica per biostampare direttamente sferoidi epiteliali del seno 3D pre-formati in una varietà di bioinchiostri. Gli sferoidi epiteliali del seno 3D prestampati biostampati hanno sostenuto la loro vitalità e l'architettura polarizzata dopo la stampa. Abbiamo inoltre stampato gli sferoidi 3D su reti cellulari endoteliali vascolari per creare un modello di co-coltura. Pertanto, la nuova tecnica di biostamgrafia crea rapidamente un modello di seno umano 3D più fisiologicamente rilevante a costi inferiori e con una maggiore flessibilità rispetto alle tradizionali tecniche di biostamgrafia. Questa versatile tecnica di biostamce può essere estrapolata per creare modelli 3D di altri tessuti in bioinchiostri aggiuntivi.

Le cellule epiteliali del seno dovrebbero auto-organizzarsi in sferoidi 3D dopo 5-8 giorni di coltura su soluzione matriciale e in mezzo di coltura con soluzione matriciale al 2%. Gli sferoidi epiteliali al seno MCF10A non cancerogeni dovrebbero apparire rotondi e avere un centro cavo, con l'integrina α6 polarizzata al bordo esterno dello sferoide(Figura 1, l'interno mostra centri cavi). Le cellule epiteliali del cancro al seno MDA-MB-231 altamente invasive formano sferoidi irregolari. Gli ...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K Views.  Drexel University. L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Video: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabbricazione assistita da microscopia dell'ossigeno a prezzi accessibili di sferoidi multicellulari

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.