Esta pesquisa foi financiada pelo NIH 1R01HL140239-01 para a AMC. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Imagens Celulares da Universidade Drexel.

1. Crescimento de células epiteliais mamárias e mídia de ensaio
<ol><li>Células epiteliais mamárias MCF10A NOTA: A linha de células epiteliais de mama imortalizada não tumorigênica é derivada de uma paciente com doença fibrocística43. As células não expressam receptor de estrogênio.<ol>
<li>Para preparar 20 μg/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), dissolva 100 μg de EGF liofilizado em 500 μL de dH2O estéril para fazer 200 μg/mL EGF. Adicione 500 μL de 200 μg/mL EGF em 4,5 mL de BSA estéril de 0,1% em dH2O para fazer uma solução de estoque EGF de 20 μg/mL. Loja preparada 20 μg/mL EGF alíquotas a -20 °C por até 12 meses.</li>
		<li>Para preparar 500 μg/mL hidrocortisona, diluir 1 mg de hidrocortisona em 1 mL de etanol absoluto (prova de 200). Adicione 1 mL de DMEM F:12 estéreis a esta mistura para fazer uma solução de estoque de hidrocortisona de 500 μg/mL. Armazene alíquotas de estoque de hidrocortisona a -80 °C por até 12 meses.</li>
		<li>Para preparar 10 μg/mL toxina da cólera, dissolva 1 mg de pó liofilizado de toxina cólera em 1 mL de dH2O estéril para fazer uma solução de estoque de toxina de cólera de 1 mg/mL. Armazene alíquotas de estoque de toxinas de cólera a -80 °C por até 12 meses.</li>
		<li>Para preparar o Growth Medium, adicione 500 μL de EGF (20 μg/mL), 500 μL de hidrocortisona (500 μg/mL), 5 μL de toxina de cólera (1 mg/mL), 500 μL de insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL de penicilina e estreptomia, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM F:12 para uma concentração final de 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL hidrocortisona, 10 ng/mL toxina de cólera, 10 ng/mL insulina bovina, penicilina v/v e estreptomicina, e 5% de soro v/v de cavalo. A concentração de antibióticos foi aumentada para 2% para explicar a diminuição da esterilidade no processo de bioimpressão; no entanto, a concentração de antibióticos pode ser reduzida para 1%.</li>
		<li>Para preparar o Assay Medium, adicione 500 μL de hidrocortisona (500 μg/mL), 5 μL de toxina de cólera (1 mg/mL), 500 μL de insulina bovina (10 mg/mL), 10 mL de penicilina e estreptomicina, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM F:12 para uma concentração final de 500 ng/mL hidrocortisona, 10 ng/mL micose de cólera, 10 ng/mL insulina bovina, 2% v/v penicilina e estreptomicina, e 5% v/v de soro de cavalo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 NOTA: A linha celular epitelial do câncer de mama triplamente negativa (sem receptor de estrogênio, receptor de progesterona e receptor de fator de crescimento epidérmico 2) é criada a partir da efusão pleural de uma paciente do sexo feminino com adenocarcinoma mamário metastático44. As células representam um câncer de mama agressivo, invasivo e pouco diferenciado.<ol>
<li>Para preparar o Crescimento e o Médio de Ensaio, adicione 50 mL de soro bovino fetal, 10 mL de penicilina e estreptomicina, e 25 mL de soro de cavalo a 500 mL de DMEM para concentração final 10% v/v soro bovino fetal, 2% v/v penicilina e estreptomicina, e 5% v/v de soro bovino.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura celular epitelial mamária
<ol><li>Semente 500.000 células MCF10A ou MDA-MB-231 em um prato de cultura de tecido de 10 cm (P100) com 10 mL de mcf10A ou mídia de crescimento MDA-MB-231. As células MCF10A e MDA-MB-231 atingem >90% de confluência em 48 horas.</li>
	<li>Para passar células epiteliais mamárias, primeiro lavar células com 10 mL de PBS quente.</li>
	<li>Despete as células epiteliais da mama adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 20-25 minutos.</li>
	<li>Adicione 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium às células experimentpsinizadas para neutralizar a trippsina. Pipeta a mistura de mídia celular para cima e para baixo para resuspend células e quebrar aglomerados celulares.</li>
	<li>Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 1.200 x g por 3 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasal e resuspenha a pelota de célula em 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium.</li>
	<li>Placa 1 mL de suspensão celular em 5 novos pratos de cultura tecidual de 10 cm, juntamente com MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. As células estarão prontas para serem passagem novamente em 2-3 dias. As células MCF10A podem ser mantidas na passagem número 35, após a qual apresentam alterações morfológicas. As células MDA-MB-231 podem ser mantidas na passagem número 24, após a qual apresentam alterações morfológicas.</li>
</ol>3. Formação esferoide Epitelial de Mama
<ol><li>Congele 200 pontas de pipeta μL por 30 minutos antes de iniciar o ensaio. Mantenha a solução matricial reduzida do fator de crescimento (por exemplo, Matrigel) (10 mg/mL) no gelo durante todo o processo.</li>
	<li>Pipeta lentamente 30 μL de solução de matriz gelada usando pontas de pipeta de 200 μL geladas em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços. Comece pelos lados e arraste a ponta da pipeta ao longo dos cantos, adicionando uma gota final ao centro do poço para garantir um revestimento uniforme de cada poço. Evite bolhas de ar durante esta etapa para garantir uma camada uniforme de solução de matriz. Use novas dicas de pipeta para cada poço.</li>
	<li>Incubar lâminas de câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 15-20 minutos para polimerizar a solução matricial.</li>
	<li>Células MCF10A experimentadas de resuspendam em 200.000 células/mL ou células MDA-MB-231 experimentadas em MDA-MB-231 Em MDA-MB-231 Growth Medium a 200.000 células/mL.</li>
	<li>Se usar células MCF10A, prepare o novo McF10A Spheroid Growth Medium adicionando 5 μL de EGF (20 μg/mL) e 100 μL de solução matricial a 5 mL de Assay Medium para uma concentração final de 2% de solução matricial.</li>
	<li>Remova o slide da câmara pré-revestido com solução de matriz da incubadora. Adicione 50 μL de suspensão celular MCF10A ou MDA-MB-231 (10.000 células) a cada poço. Se usar células MCF10A, adicione 450 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium. Se usar células MDA-MB-231, adicione 450 μL de MDA-MB-231 Growth Medium pré-misturada com solução de matriz de 2% (9 μL). Coloque imediatamente o deslizamento da câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua o meio a cada 4 dias. Pipeta cuidadosamente 200 μL de mídia antiga de um canto de cada poço usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Durante este processo, incline o deslizamento da câmara a 45° para garantir que os esferoides não sejam perturbados. Adicione 200 μL de McF10A Spheroid Growth Medium recém-preparado ou MDA-MB-231 Growth Medium previamente misturado com solução de matriz de 2% para cada poço no canto em gotas para garantir que os esferoides permaneçam ligados à matriz de camadas. Apenas ~50% da mídia é substituída para que todas as citocinas produzidas pelos esferoides não estejam completamente esgotadas. NOTA: Os epitélios mamários MCF10A levam até 8 dias para polarizar e formar centros ocos. Os esferoides epiteliais mamários MDA-MB-231 levam até 5 dias para se formar e não têm centros ocos.</li>
</ol>4. Formação da Rede celular endotelial
<ol><li>Cultura da Célula Endotelial da Veia Umbilical Humana (HUVEC)<ol>
<li>Adicione o conteúdo de um único kit de crescimento endotelial médio-2 contendo fator de crescimento de insulina, fator de crescimento do fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular, ácido ascórbico, fator de crescimento epidérmico, heparina e gentamicina-anfotericina B, juntamente com 50 mL de soro bovino fetal, penicilina-estreptomicina de 5 mL e 5 mL de glutamina de 200 mM a 500 mL de Médio-2 Basal Endotelial (EBM-2) para criar médio completo de crescimento endotelial (EGM-2).</li>
		<li>Semente 500.000 células endoteliais em um prato de cultura tecidual de 10 cm em 10 mL de EGM-2. Coloque as células em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 até atingirem >80% de confluência (em torno de 48 horas).</li>
		<li>Para as células de passagem, lave as células endoteliais com 10 mL de PBS quente. Desprender huvec adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato de cultura tecidual de 10 cm. Monitore de perto as células por microscopia de contraste de fase. As células estão prontas quando estão emarinhadas, mas permanecem presas ao prato.</li>
		<li>Aspire cuidadosamente o trypsin para fora do prato. Adicione 8 mL de EGM-2 ao prato. Lave as células do prato, pipetando o EGM-2 para cima e para baixo sobre toda a superfície do prato.</li>
		<li>Alternativamente, adicione 5 mL de EGM-2 às células experimentadas para neutralizar a trippsina. Pipeta a mistura de mídia celular para cima e para baixo para resuspend células e quebrar aglomerados celulares. Adicione a suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 1.200 x g por 3 minutos. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspenja a pelota de célula em 10 mL de EGM-2.</li>
		<li>Adicione 1 mL de suspensão celular a 9 mL de EGM-2 em um prato de cultura tecidual de 10 cm. Coloque os pratos em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2. Troque 2/3 do meio com EGM-2 fresco a cada 2 dias. As células estarão prontas para passar em 3-5 dias. O HUVEC pode ser mantido até a passagem 8 após o qual eles não conseguem formar redes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formação de Rede de Células Endoteliais (HUVEC)</li>
	<li>Congele 200 pontas de pipeta μL por 30 minutos antes de iniciar o ensaio. Mantenha a solução matricial reduzida do fator de crescimento (10 mg/mL) no gelo durante todo o processo.</li>
	<li>Pipeta lentamente 30 μL de solução de matriz gelada usando pontas de pipeta de 200 μL geladas em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços. Comece pelos lados e arraste a ponta da pipeta ao longo dos cantos, adicionando uma gota final ao centro do poço para garantir um revestimento uniforme de cada poço. Evite bolhas de ar durante esta etapa para garantir uma camada uniforme de solução de matriz. Use novas dicas de pipeta para cada poço.</li>
	<li>Incubar lâminas de câmara em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 por 15-20 minutos para polimerizar Matrigel.<ol>
<li>Pré-colorir um prato de 10 cm de HUVEC com 10 μL de rastreador de célula vermelha (1:1000) por 30 minutos em 37 °C, 5% incubadora CO2.</li>
		<li>Lave células endoteliais com 10 mL de PBS quente. Desprender huvec adicionando 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA ao prato de cultura tecidual de 10 cm. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por 5 minutos para desprender totalmente as células.</li>
		<li>Adicione 5 mL de EGM-2 ao prato para neutralizar o trypsin. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 25 mL. Centrifugar HUVEC a 1.200 x g por 5 minutos. Aspire o supernasce e resuspense a pelota celular em 5 mL de EBM-2 sem soro.</li>
		<li>Conte células usando azul Trypan para determinar células viáveis. Crie uma solução de 1 x 106 células/mL.</li>
		<li>Adicione 100.000 HUVEC a cada poço com 200 μL de EBM-2 sem soro. Se mais células forem adicionadas, elas criarão uma monocamada superficial em vez de uma rede de tubos.</li>
		<li>Incubar huvec em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2. Após 6 horas, imagem redes HUVEC por microscopia de contraste de fase. As redes estão prontas para a cocultura com esferoides de mama.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioimpressão Epiteliais epitelóides em redes HUVEC pré-formadas
NOTA: Um sistema de bio-deposição de bico duplo deve ser usado para o processo de biofabização. Neste caso, o sistema tinha três braços de movimento para permitir o controle espacial em escala de micron da deposição de material, bem como dois motores acionados por parafuso para depositar bioink a partir de seringas de 10 mL. O sistema deve ser funcionalizado com um sistema de filtragem de ar particulado de alta eficiência, bem como capacidades de esterilização UV para manter um ambiente estéril durante a bioimpressão. A bioimpressora é esterilizada por uma hora antes do processo de impressão.
<ol><li>Crie esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC como descrito anteriormente. Estimar o número de esferoides epiteliais mamários em cada poço contando esferoides em imagens de microscopia de contraste de fase representativa.</li>
	<li>Corte 0,5 cm da extremidade de uma ponta de pipeta de 1000 μL. Use a ponta de pipeta cortada para pipeta cuidadosamente todos os esferoides fora do deslizamento de câmara de 8 poços e em um tubo de 50 mL. Spheróides resuspend no bioink selecionado a 100 esferoides/100 μL. NOTA: Concentrações mais elevadas de esferoides podem resultar em agrupamento esferoides e impedir a visualização de interações entre os esferoides e as redes endoteliais.</li>
	<li>Passe a mistura de esferoides através de um coador de células de 70 μm para remover quaisquer esferoides grandes ou agrupados.</li>
	<li>Carregue os esferoides agrupados em uma seringa estéril de 10 mL e tampe-a com uma agulha estéril de calibre 25. Conecte a seringa ao sistema de bio-deposição.</li>
	<li>Aspire o meio fora das redes HUVEC no slide de câmara de 8 poços.</li>
	<li>Extrude 100 μL de esferoides epiteliais mamários em 6 poços de redes HUVEC a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Mantenha 2 poços de redes HUVEC como controles.</li>
	<li>Adicione 400 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium se usar spheroids MCF10A impressos em redes HUVEC ou adicionar 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium previamente misturado com solução de matriz de 2% se usar spheroids MDA-MB-231 impressos em redes HUVEC. O respectivo meio de crescimento esferoide deve ser utilizado em poços de controle HUVEC.</li>
	<li>Incubar co-culturas em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 24 – 96 horas sem alteração de mídia. As coculturas permanecerão viáveis no meio original por até quatro dias.</li>
</ol>6. Microscopia Confocal
<ol><li>Preparação de tampão de lavagem de imunofluorescência e PBS-Glycine<ol>
<li>Prepare a solução de estoque tampão de imunofluorescência (IF) 10x adicionando 2,5 g de azida de sódio, 5 g de albumina de soro bovino, 10 mL de Triton X-100 e 2,05 mL de Tween-20 em 500 mL de 10x PBS. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução de estoque por até um ano a 4 °C para evitar sedimentação.</li>
		<li>Crie um buffer IF funcionando diluindo 50 mL de 10x IF tampão em 450 mL de água deionizada estéril. Armazene a solução de trabalho em temperatura ambiente por até uma semana.</li>
		<li>Prepare a solução de estoque tampão PBS-Glycine de 10x adicionando 37,5 g de glicina a 500 mL de PBS 10x. Ajuste o pH para 7,4. Armazene a solução de estoque por até 6 meses a 4 °C para evitar sedimentação.</li>
		<li>Crie uma solução PBS-Glycine em funcionamento diluindo 50 mL de tampão PBS-Glycine de 10x em 450 mL de água desionizada estéril. Armazene a solução de trabalho a 4 °C por até uma semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rotular Amostras bioimpressoras e imagem por Microscopia Confocal<ol>
<li>Aspirar meio a partir de co-culturas 3D bioimpressionadas e enxaguar 3 vezes com PBS quente. Corrija co-culturas 3D bioimpressoras com 4% de paraformaldeído por 1 h à temperatura ambiente. Enxágüe amostras 3 vezes por 20 minutos com 1x PBS-Glycine.</li>
		<li>Bloqueie amostras com tampão IF misturado com soro de cabra de 10% por 90 minutos (bloco primário), seguido de 40 minutos com tampão IF mais 10% de soro de cabra e fragmento de Affinipure Fab (1:100, bloco secundário).</li>
		<li>Se usar esferoides MCF10A, rotule amostras com um anticorpo primário para integrin α6 (1:100) no buffer de bloqueio secundário durante a noite a 4 °C, seguido por um Alexa Fluor 488 anticorpo secundário (1:200) e Hoescht 33342 (1:1000) para 1h à temperatura ambiente protegido da luz. As linhas celulares MCF10A expressam altos níveis de integrin α6, o que é essencial para mostrar polarização e morfologia efpheróides.</li>
		<li>Se usar spheroids MDA-MB-231, que expressam baixos níveis de integrin α6, rotule amostras com Alexa Fluor 488 fálice (1:100) e Hoescht 33342 (1:1000) em tampão de bloqueio secundário por 4 horas à temperatura ambiente protegido da luz. A falotinina permite a visualização de filamentos de actina para que a morfologia amorfo e invasiva e esfélide possa ser avaliada.</li>
		<li>Lave amostras com 1X PBS-glycine 3 vezes por 20 minutos.</li>
		<li>Prepare amostras para montagem removendo o slide da câmara usando a ferramenta do fabricante. Adicione uma pequena gota de solução antifade a cada poço. Coloque uma tampa de 22 mm x 60 mm em cada slide de câmara e sele cuidadosamente as bordas com esmalte claro.</li>
		<li>Amostras de imagem usando um microscópio confocal como pilhas Z de ~10 fatias em passos de 5 μm. Se desejar, comprimir os planos Z em um único plano usando o comando Extended Focus no software de imagem celular.</li>
		<li>Quantifique a adesão eferóide às redes endoteliais usando a imagem J. O número de esferoides aderidos pode ser quantificado usando o plugin de análise com o tamanho e circularidade de partículas apropriados. Normalize o número de esferoides conectados à área de imagem.</li>
		<li>Para garantir a reprodutibilidade, quantifique o número de esferoides aderidos em imagens de 4 x 4 de azulejos de co-culturas. Se o número de esferoides for estatisticamente significativamente menor do que outros experimentos, o experimento deve ser repetido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo é o primeiro de seu tipo a bioimpressão spheroids em sua arquitetura 3D para co-cultura com células endoteliais também em sua arquitetura 3D. As etapas críticas do protocolo incluem a formação inicial de esferoides epiteliais mamários e redes HUVEC. Deve-se ter extrema cautela na alimentação de esferoides epiteliais mamários, pois são facilmente interrompidos da solução matricial. Da mesma forma, os esferoides epiteliais mamários devem ser tratados com cuidado quando são pipetted fora da so...

Modelos de tumores vascularizados in vitro 3D são ferramentas essenciais para o estudo mecanicista do crescimento do câncer e da metástase. Para o câncer de mama em particular, as células epiteliais mamárias cultivadas em Matrigel se organizam em esferoides polarizados que se assemelham mais à arquitetura acinus mamária in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. A cultura epitelial da mama 3D também impacta a função celular, com culturas 3D mostrando diferenças na modulação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF)8,9; função oncogene, incluindo ErbB210; crescimento e apoptose sinalizando11,12; e resistência à quimioterapia13,14. As células endoteliais vasculares respondem de forma semelhante aos estímulos ambientais em 3D vs. cultura 2D tradicional15,16,17,18. No entanto, grande parte da compreensão das interações epiteliais vasculares e mamárias vem da cultura 2D usando pastilhas médias ou transwell condicionadas, ou modelos 3D nos quais os dois tipos de células são fisicamente separados19,20,21,22,23. Esses modelos de cocultura fornecem uma visão fisiológica limitada, uma vez que tanto a cultura 3D quanto o contato celular-célula são fundamentais para a endotelial vascular – interações epiteliais mamárias24,25,26.
Modelos de câncer 3D foram fabricados utilizando uma variedade de técnicas, incluindo formação de spheroid suspensa, bioimpressão, montagem magnética e cultura dentro de hidrogéis ou em andaimes projetados5,27,28,29. Mais recentemente, modelos de tumor 3D foram criados com vários tipos de células dispostos em suas respectivas estruturas 3D. Em um exemplo de uma plataforma tumor-on-a-chip, câncer, células endoteliais e estromais foram misturados em uma matriz e, em seguida, injetados nas três câmaras centrais de tecido em um dispositivo polidimetilsiloxano (PDMS). As câmaras de tecido eram cercadas por dois canais externos que representavam uma artéria e venule. Após 5-7 dias de cultura, as células endoteliais formaram uma rede microvascular e as células cancerígenas proliferaram para formar pequenos tumores perto da vasculatura. Esta plataforma foi então usada para rastrear drogas e combinações de drogas30. Plataformas adicionais de tumor-on-a-chip foram criadas para estudar metástase e tipos de câncer com estímulos mecânicos específicos (por exemplo, tensão mecânica no pulmão)31,32. No entanto, essas plataformas geralmente não incluem vasculatura e câncer em suas respectivas estruturas 3D.
A biofabização mostra grande promessa no avanço de modelos de tumores vascularizados in vitro 3D, uma vez que permite um controle espacial rigoroso sobre a localização celular. Apesar do crescimento da bioimpressão na última década, poucos estudos se concentram especificamente nos tumores33,34. Em um exemplo, a impressão 3D de células HeLa em um hidrogel gelatina/alginato/fibrinogen foi usada para criar um modelo de câncer cervical in vitro. As células tumorais foram bioimpressas como células individuais e, em seguida, autorizadas a formar esferoides, que apresentaram maior taxa de proliferação, aumento da expressão metaloproteinase matricial e maior que a quimiosistência do que as células na cultura 2D35. Nesses estudos, como em muitos outros36,37, as suspensões celulares dissociadas foram bioimpressionadas, e então as culturas celulares foram fornecidas com as sugestões mecânicas e bioquímicas necessárias para permitir que as células formassem uma estrutura 3D. No entanto, a automontagem celular pode levar dias ou semanas, pode exigir pistas ambientais espaciais e temporais complexas, ou pode não ocorrer quando dois tipos de células são co-cultivados. Por exemplo, as células epiteliais mamárias induziram a morte celular em células endoteliais em cocultura 2D, e as células epiteliais de mama dissociadas não formaram esferoides 3D quando bioimpressionadas em hidrogéis de alginato/gelatina38. Células epiteliais de mama dissociadas ou cancerosas formaram esferoides em bioinks à base de alginato somente quando presos em moldes PDMS circulares. Em outros casos, os esferoides foram formados usando gotículas suspensas em placas de poço circular de fixação ultra-baixa e, em seguida, misturados em bioinks à base de alginato39,40.
Descrevemos agora um método alternativo de biomafação de tecido 3D neste protocolo. Em vez de células dissociadas de sementes e esperar que essas células formem as estruturas 3D, descrevemos como criar e bioimpressular spheróides tumorais 3D em uma rede de tubos vasculares para criar um modelo de co-cultura tumoral que pode ser usado quase imediatamente. Os esferoides tumorais podem ser cultivados in vitro ou derivados de tecidos humanos (organoides). Da mesma forma, os tubos vasculares podem ser cultivados ou podem ser derivados de fragmentos microvasculares teciduais adiposos. Os bioinks podem variar de alginato biologicamente inativo ao Matrigel41altamente biologicamente ativo . Uma vez que este modelo de cocultura tumoral 3D pode ser criado com uma variedade de estruturas celulares e bioinks, ele pode incorporar vários tipos de células, matrizes extracelulares e gradientes de quimiocina15,42. Enquanto em sua formulação atual, as redes endoteliais não podem ser perfundidas, futuras iterações poderiam integrar esse método com microfluidos ou sistemas -on-chip. Bioimpressão epitelial 3D em redes endoteliais permite a biofabricação rápida de modelos de mama humana para testes de drogas e medicina de precisão personalizada27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

A bioimpressão está emergindo como uma ferramenta promissora para fabricar modelos de câncer humano 3D que melhor recapitulem marcas críticas da arquitetura de tecidos in vivo. Na bioimpressão atual de extrusão de camada por camada, as células individuais são extrudadas em um bioink juntamente com pistas espaciais e temporais complexas para promover a auto-montagem do tecido hierárquico. No entanto, essa técnica de biofabricação conta com interações complexas entre células, bioinks e sinais bioquímicos e biofísicos. Assim, a automontagem pode levar dias ou até semanas, pode exigir bioinks específicos, e pode nem sempre ocorrer quando há mais de um tipo de célula envolvida. Desenvolvemos, portanto, uma técnica para bioimpressão pré-formada esferoides epiteliais de mama 3D em uma variedade de bioinks. Os esferoides epiteliais de mama 3D pré-formados bioimpressas sustentaram sua viabilidade e arquitetura polarizada após a impressão. Também imprimimos os esferoides 3D em redes de células endoteliais vasculares para criar um modelo de co-cultura. Assim, a nova técnica de bioimpressão cria rapidamente um modelo de mama humano 3D mais fisiologicamente relevante a um custo menor e com maior flexibilidade do que as técnicas tradicionais de bioimpressão. Esta técnica versátil de bioimpressão pode ser extrapolada para criar modelos 3D de outros tecidos em bioinks adicionais.

As células epiteliais mamárias devem se auto-organizar em esferoides 3D após 5-8 dias de cultura sobre solução matricial e em meio de cultura com solução de matriz de 2%. Epitóides epiteliais não tumorigênicos MCF10A devem aparecer redondos e ter um centro oco, com integrin α6 polarizado à borda externa do esferoide(Figura 1, inset mostra centros ocos). Células epiteliais altamente invasivas MDA-MB-231 formam esferoides irregulares. Os esferoides devem ser usados quando tiverem ...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K visualizações.  Drexel University. O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.