Name: direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Diese Forschung wurde von NIH 1R01HL140239-01 an AMC finanziert. Wir bedanken uns beim Cell Imaging Center der Drexel University.

1. Brustepithelzellwachstum und Assay-Medien
<ol><li>MCF10A Brustepithelzellen HINWEIS: Die nicht-tumorigenic verewigte Brustepithelzelllinie wird von einem Patienten mit fibrozystischer Erkrankungabgeleitet 43. Zellen drücken keinen Östrogenrezeptor aus.<ol>
<li>Um den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) von 20 g/ml vorzubereiten, lösen Sie 100 g lyophilisierten EGF in 500 l sterilen dH2O auf, um 200 g/ml EGF zu bilden. Fügen Sie 500 l von 200 g/ml EGF in 4,5 ml sterile 0,1% BSA in dH2O hinzu, um eine EGF-Lagerlösung mit 20 sg/ml herzustellen. Vorbereitete 20 g/ml EGF-Aliquots bei -20 °C für bis zu 12 Monate lagern.</li>
		<li>Zur Zubereitung von 500 g/ml Hydrocortison 1 mg Hydrocortison in 1 ml absolutem Ethanol (200 Nachweis) verdünnen. Fügen Sie 1 ml steriles DMEM F:12 zu dieser Mischung hinzu, um eine 500 g/ml Hydrocortison-Stammlösung herzustellen. Hydrocortison-Lager-Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate lagern.</li>
		<li>Um 10 g/ml Choleratoxin vorzubereiten, lösen Sie 1 mg Choleratoxin lyophilisiertes Pulver in 1 ml sterilem dH2O auf, um eine 1 mg/ml Choleratoxin-Stammlösung herzustellen. Speichern Sie Cholera-Toxin-Lager Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate.</li>
		<li>Zur Vorbereitung des Wachstumsmediums werden 500 l EGF (20 g/ml), 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum. Die Antibiotikakonzentration wurde auf 2 % erhöht, um die verminderte Sterilität im Bioprinting-Prozess zu berücksichtigen; die Antibiotikakonzentration kann jedoch auf 1% gesenkt werden.</li>
		<li>Zur Vorbereitung von Assay Medium 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 HINWEIS: Die dreifach-negative (fehlende Östrogen-Rezeptor, Progesteron-Rezeptor, und epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2) Brustkrebs-Epithel-Zelllinie wird aus Pleuraerguss einer weiblichen Patientin mit metastasierendem Mamma-Adenokarzinom44erstellt. Zellen stellen einen aggressiven, invasiven und schlecht differenzierten Brustkrebs dar.<ol>
<li>Zur Vorbereitung von Growth and Assay Medium 50 ml fetales Rinderserum, 10 ml Penicillin und Streptomycin und 25 ml Pferdeserum zu 500 ml DMEM für eine Endkonzentration 10% v/v fetales Rinderserum, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Brustepithelzellkultur
<ol><li>Samen 500.000 MCF10A oder MDA-MB-231 Zellen in einer 10 cm (P100) Gewebekulturschale mit 10 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Wachstumsmedien. MCF10A- und MDA-MB-231-Zellen erreichen >90% Zusammenfluss in 48 Stunden.</li>
	<li>Um Brustepithelzellen zu durchziehen, waschen Sie zuerst Zellen mit 10 ml warmem PBS.</li>
	<li>Lösen Sie Brustepithelzellen, indem Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Schale geben. Legen Sie das Gericht in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 20-25 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie den Trypsinisierten Zellen 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen.</li>
	<li>Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium wieder aufsetzen.</li>
	<li>Platte 1 ml Zellsuspension in 5 neuen 10 cm Gewebekulturschalen zusammen mit MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Die Zellen können in 2-3 Tagen wieder durchgesieben werden. MCF10A-Zellen können bis zu Durchgang s 35 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen. MDA-MB-231-Zellen können bis Durchgang S24 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen.</li>
</ol>3. Brust epitheliale Sphäroid-Formation
<ol><li>Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (z. B. Matrigel) (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.</li>
	<li>Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.</li>
	<li>Inkubationskammergleitet in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um die Matrixlösung zu polymerisieren.</li>
	<li>Setzen Sie trypsinisierte MCF10A-Zellen in MCF10A Assay Medium bei 200.000 Zellen/ml aus oder setzen Sie trypsinisierte MDA-MB-231-Zellen in MDA-MB-231 Growth Medium bei 200.000 Zellen/ml wieder aus.</li>
	<li>Bei Verwendung von MCF10A-Zellen bereiten Sie frisches MCF10A Spheroid Growth Medium vor, indem Sie 5 l EGF (20 g/ml) und 100 l Matrixlösung zu 5 ml Assay Medium für eine Endkonzentration von 2% Matrixlösung hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie den mit Matrixlösung vorbeschichteten Kammerschlitten aus dem Inkubator. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L MCF10A oder MDA-MB-231 Zellsuspension (10.000 Zellen) hinzu. Wenn Sie MCF10A-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu. Wenn Sie MDA-MB-231-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MDA-MB-231 Growth Medium vorgemischt mit 2% Matrixlösung (9 l) hinzu. Stellen Sie die Kammerrutsche sofort in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium alle 4 vier Tage. Mit einer 200-L-Pipettenspitze aus einer Ecke jedes Brunnens heraus pipette 200 l alte Medien. Kippen Sie dabei den Kammerschlitten um 45°, um sicherzustellen, dass die Sphäroide nicht gestört werden. Fügen Sie 200 L frisch zubereitetes MCF10A Spheroid Growth Medium oder MDA-MB-231 Growth Medium, das zuvor mit 2% Matrixlösung gemischt wurde, zu jedem Brunnen an der Ecke in Tropfen hinzu, um sicherzustellen, dass Sphäroide an der Matrixschicht befestigt bleiben. Nur 50 % der Medien werden ersetzt, so dass alle zytokinen, die von den Sphäroiden produziert werden, nicht vollständig erschöpft sind. HINWEIS: MCF10A Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 8 Tage, um zu polarisieren und Hohlzentren zu bilden. MDA-MB-231 Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 5 Tage, um sich zu bilden und haben keine Hohlzentren.</li>
</ol>4. Endotheliale Zellnetzbildung
<ol><li>Human Umbilical Venin Endothelzelle (HUVEC) Kultur<ol>
<li>Fügen Sie den Inhalt eines einzigen Endotheliale Wachstums Medium-2-Kits hinzu, das Insulinwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor enthält, Ascorbinsäure, epidermaler Wachstumsfaktor, Heparin und Gentamicin-Amphotericin B, zusammen mit 50 ml fetalem Rinderserum, 5 ml Penicillin-Streptomycin und 5 ml 200 mM Glutamin bis 500 ml Endothelialebasal Medium-2 (EBM-2) zu einem vollständigen Endothel-Wachstumsmedium (EGM-2).</li>
		<li>Samen 500.000 Endothelzellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in 10 ml EGM-2. Legen Sie Zellen in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie >80% Konfluenz erreichen (ca. 48 Stunden).</li>
		<li>Um Zellen zu durchziehen, waschen Sie Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Überwachen Sie die Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie. Die Zellen sind bereit, wenn sie aufgeballt werden, bleiben aber an der Schale befestigt.</li>
		<li>Das Trypsin vorsichtig aus der Schale saugen. Fügen Sie 8 ml EGM-2 in das Gericht. Waschen Sie zellenvon der Schale, indem Sie den EGM-2 über die gesamte Telleroberfläche nach oben und unten pfeifen.</li>
		<li>Alternativ können Sie den Trypsin-Zellen 5 ml EGM-2 hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen. Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 10 ml EGM-2 wieder aufhängen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml Zellsuspension zu 9 ml EGM-2 in einer 10 cm Gewebekulturschale hinzu. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Tauschen Sie 2/3 des Mediums alle 2 Tage mit frischem EGM-2 um. Die Zellen können in 3-5 Tagen durchforsst werden. HUVEC kann bis Zugänge 8 aufrechterhalten werden, nach denen sie keine Netzwerke bilden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endothelzelle (HUVEC) Netzwerkbildung</li>
	<li>Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.</li>
	<li>Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.</li>
	<li>Inkubationskammer gleitet in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um Matrigel zu polymerisieren.<ol>
<li>Eine 10 cm große Schale HUVEC mit 10 l Rote-Zell-Tracker (1:1000) 30 Minuten in 37 °C, 5% CO2-Inkubator vorfärben.</li>
		<li>Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS waschen. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 5 Minuten, um die Zellen vollständig zu lösen.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml EGM-2 in die Schale, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 25 ml konisches Rohr. Zentrifuge HUVEC bei 1.200 x g für 5 Minuten. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 5 ml serumfreiem EBM-2 wieder aufhängen.</li>
		<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um lebensfähige Zellen zu bestimmen. Erstellen Sie eine 1 x 10 6-Zellen/ml-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie 100.000 HUVEC zu jedem Brunnen mit 200 L serumfreien EBM-2 hinzu. Wenn mehr Zellen hinzugefügt werden, erstellen sie eine Oberflächenmonolayer anstelle eines Rohrnetzwerks.</li>
		<li>HUVEC in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator inkubieren. Nach 6 Stunden, Bild HUVEC Netzwerke durch Phasenkontrastmikroskopie. Netzwerke sind jetzt bereit für die Kokultur mit Brustsphäroiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioprinting Brustepithelial sphäroide auf vorgeformten HUVEC-Netzwerken
HINWEIS: Für den Bioherstellungsprozess sollte ein Bio-Abscheidungssystem mit zwei Düsen verwendet werden. In diesem Fall verfügte das System über drei Bewegungsarme, um eine räumliche Kontrolle der Materialabscheidung im Mikronmaßstab zu ermöglichen, sowie über zwei schraubengetriebene Motoren, um Bioink aus 10 ml Spritzen abzulagern. Das System sollte mit einem hocheffizienten Partikelluftfiltrationssystem sowie UV-Sterilisationsfunktionen funktionalisiert werden, um eine sterile Umgebung während des Bioprintings zu erhalten. Der Bioprinter wird vor dem Druckvorgang eine Stunde lang UV-sterilisiert.
<ol><li>Erstellen Sie Brustepithelisaleroiide und HUVEC-Netzwerke, wie zuvor beschrieben. Schätzen Sie die Anzahl der Brustepithelialsphäroide in jedem Brunnen, indem Sie Sphäroide in repräsentativen Phasenkontrastmikroskopiebildern zählen.</li>
	<li>0,5 cm vom Ende einer 1000 L Pipettespitze abschneiden. Verwenden Sie die geschnittene Pipettenspitze, um alle Sphäroide aus dem 8-Well-Kammerschlitten und in ein 50 ml-Rohr sorgfältig zu pipette. Resuspend Sphäroide in der ausgewählten Bioink bei 100 Sphäroide/100 l. HINWEIS: Höhere Sphäroidkonzentrationen können zu Sphäroidclustering führen und die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen den Sphäroiden und den Endothelnetzwerken verhindern.</li>
	<li>Übergeben Sie die Sphäroidmischung durch ein 70-m-Zellsieb, um große oder gruppierte Sphäroide zu entfernen.</li>
	<li>Die gepoolten Sphäroide in eine 10 ml sterile Spritze geben und mit einer 25-Spur-Sterilnadel verschließen. Befestigen Sie die Spritze am Bio-Abscheidungssystem.</li>
	<li>Saugen Sie das Medium aus den HUVEC-Netzwerken in der 8-Well-Kammerrutsche.</li>
	<li>Extrudieren Sie 100 l Brustepithelialsphäride auf 6 Brunnen von HUVEC-Netzwerken mit einer Durchflussrate von 1 ml/min. Verwalten Sie 2 Brunnen von HUVEC-Netzwerken als Steuerungen.</li>
	<li>Fügen Sie 400 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu, wenn Sie MCF10A Sphäroide verwenden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt werden, oder 400 L MDA-MB-231 Growth Medium hinzufügen, das zuvor mit einer Matrixlösung von 2% gemischt wurde, wenn MDA-MB-231 Sphäroide verwendet werden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt wurden. Das jeweilige Sphäroid-Wachstumsmedium sollte in HUVEC-Kontrollbrunnen eingesetzt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie Kokulturen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 24 – 96 Stunden ohne Medienwechsel. Die Kokulturen werden im ursprünglichen Medium bis zu vier Tage lebensfähig bleiben.</li>
</ol>6. Konfokale Mikroskopie
<ol><li>Immunfluoreszenz und PBS-Glycin-Waschpuffer-Vorbereitung<ol>
<li>Vorbereiten Sie Immunofluoreszenz (IF) Puffer 10x Stammlösung durch Zugabe von 2,5 g Natriumazid, 5 g Rinderserumalbumin, 10 ml Triton X-100 und 2,05 ml Tween-20 in 500 ml 10x PBS. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu einem Jahr bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie einen funktionierenden IF-Puffer, indem Sie 50 ml 10x IF-Puffer in 450 ml sterilen entionisiertem Wasser verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei Raumtemperatur auf.</li>
		<li>Bereiten Sie 10x PBS-Glycin-Puffer-Lagerlösung vor, indem Sie 37,5 g Glycin zu 500 ml 10x PBS hinzufügen. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu 6 Monate bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie eine funktionierende PBS-Glycin-Lösung, indem Sie 50 ml 10x PBS-Glycin-Puffer in 450 ml sterilen entionisierten Wassers verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei 4 °C auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label Bioprinted Samples and Image by Confocal Microscopy<ol>
<li>Aspirieren Sie Medium aus bioprinted 3D-Kokulturen und spülen Sie 3 mal mit warmen PBS. Fix bioprinted 3D Kokulturen mit 4% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur. Proben 3 mal für 20 Minuten mit 1x PBS-Glycin emiten.</li>
		<li>Blockproben mit IF-Puffer gemischt mit 10% Ziegenserum für 90 Minuten (Primärblock), gefolgt von 40 Minuten mit IF-Puffer plus 10% Ziegenserum und Affinipure Fab Fragment (1:100, Sekundärblock).</li>
		<li>Bei Verwendung von MCF10A-Sphäroiden proben mit einem Primärantikörper für Integrin 6 (1:100) im sekundären Sperrpuffer über Nacht bei 4 °C, gefolgt von einem Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1:200) und Hoescht 33342 (1:1000) für 1 h bei lichtgeschützter Raumtemperatur. MCF10A-Zelllinien drücken hohe Integrin-Konzentrationen aus 6, die für die Darstellung der Sphäroidpolarisation und Morphologie unerlässlich sind.</li>
		<li>Bei Verwendung von MDA-MB-231 Sphäroiden, die niedrige Integrin-Konzentrationen ausdrücken, beschriften Sie Proben mit Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) und Hoescht 33342 (1:1000) im sekundären Sperrpuffer für 4 Stunden bei Lichtschutz. Phalloidin ermöglicht die Visualisierung von Actin-Filamenten, so dass die amorphe und invasive Morphologie des Sphäroids beurteilt werden kann.</li>
		<li>Proben mit 1X PBS-Glycin 3 mal für 20 Minuten waschen.</li>
		<li>Bereiten Sie Proben für die Montage vor, indem Sie den Kammerschlitten mit dem Werkzeug des Herstellers entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen kleinen Tropfen Antifade-Lösung hinzu. Legen Sie einen 22 mm x 60 mm Abdeckzettel auf jeden Kammerschlitten und versiegeln Sie die Kanten sorgfältig mit klarem Nagellack.</li>
		<li>Bildproben mit einem konfokalen Mikroskop als Z-Stacks von 10 Scheiben in 5'm Schritten. Komprimieren Sie zkomprimiert z.B. mit dem Befehl Extended Focus in der Zellbildsoftware in eine einzelne Ebene.</li>
		<li>Quantify spheroid adheoid ad image J. Die Anzahl der haftenden Sphäroide kann mit dem Analyse-Plugin mit der entsprechenden Partikelgröße und Zirkularität quantifiziert werden. Normalisieren Sie die Anzahl der angefügten Sphäroide im Bildbereich.</li>
		<li>Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, quantifizieren Sie die Anzahl der haftenden Sphäroide in 4 x 4 gefliesten Bildern von Kokulturen. Wenn die Sphäroidzahl statistisch signifikant niedriger ist als bei anderen Experimenten, sollte das Experiment wiederholt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Sphäroide in ihrer 3D-Architektur für die Co-Kultur mit Endothelzellen auch in ihrer 3D-Architektur bioprintiert. Kritische Protokollschritte umfassen die Erstbildung von Brustepithelialsphäroiden und HUVEC-Netzwerken. Bei der Fütterung von Epithelsphäroiden ist äußerste Vorsicht geboten, da sie leicht von der Matrixlösung gestört werden können. Ebenso müssen Brustepithelilesphäroide mit Vorsicht behandelt werden, wenn sie von der Matrixlösung abgeführt und in ...

3D-in-vitro-vaskularisierte Tumormodelle sind wesentliche Werkzeuge für die mechanistische Untersuchung von Krebswachstum und Metastasen. Insbesondere bei Brustkrebs organisieren sich in Matrigel kultivierte Brustepithelzellen zu polarisierten Sphäroiden, die eher der in vivo-Mamma-Akuinusarchitektur1,2,3,4,5,6,7,8ähneln. 3D-Brustepithelzellkultur wirkt sich auch auf die Zellfunktion aus, wobei 3D-KulturenUnterschiede in der epidermalen Wachstumsfaktor-Modulation (EGF) zeigen 8,9; Onkogenfunktion, einschließlich ErbB210; Wachstum und Apoptose-Signalisierung11,12; und Chemotherapie-Resistenz13,14. Vaskuläre Endothelzellen reagieren ähnlich unterschiedlich auf Umweltreize in 3D im Vergleich zu traditioneller 2D-Kultur15,16,17,18. Ein Großteil des Verständnisses von vaskulären endotheliale und Brustepithel-Wechselwirkungen stammt jedoch aus der 2D-Kultur mit konditionierten Medium- oder Transwell-Einsätzen oder 3D-Modellen, bei denen die beiden Zelltypen physisch getrennt sind19,20,21,22,23. Diese Co-Kultur-Modelle bieten begrenzte physiologische Erkenntnisse, da sowohl 3D-Kultur als auch Zellzellkontakt entscheidend für vaskuläre endotheliale – Brustepithelzellinteraktionen24,25,26sind.
3D-Krebsmodelle wurden mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, einschließlich hängender Tropfensphäroidbildung, Bioprinting, magnetische Montage und Kultur in Hydrogelen oder auf technischen Gerüsten5,27,28,29. In jüngerer Zeit wurden 3D-Tumormodelle mit mehreren Zelltypen erstellt, die in ihren jeweiligen 3D-Strukturen angeordnet sind. In einem Beispiel einer Tumor-on-a-Chip-Plattform wurden Krebs-, Endothel- und Stromalzellen in eine Matrix gemischt und dann in die drei zentralen Gewebekammern in einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Gerät injiziert. Die Gewebekammern wurden von zwei äußeren Kanälen umrandet, die eine Arterie und Venule darstellten. Nach 5-7 Tagen Kultur bildeten Endothelzellen ein mikrovaskuläres Netzwerk und Krebszellen vermehrten sich zu kleinen Tumoren in der Nähe der Vaskulatur. Diese Plattform wurde dann verwendet, um Drogen und Drogenkombinationen zu überprüfen30. Zusätzliche Tumor-on-a-Chip-Plattformen wurden geschaffen, um Metastasen und Krebsarten mit spezifischen mechanischen Reizen (z.B. mechanische Dehnung in der Lunge) zu untersuchen31,32. Diese Plattformen enthalten jedoch in der Regel nicht sowohl Vaskulatur als auch Krebs in ihren jeweiligen 3D-Strukturen.
Die Biofertigung ist vielversprechend bei der Weiterentwicklung von 3D-in-vitro-vaskularisierten Tumormodellen, da sie eine enge räumliche Kontrolle über die Zelllage ermöglicht. Trotz des Wachstums des Bioprinting in den letzten zehn Jahren konzentrieren sich nur wenige Studien speziell auf Tumore33,34. In einem Beispiel wurde der 3D-Druck von HeLa-Zellen in einem Gelatine-/Alginat-/Fibrinogen-Hydrogel verwendet, um ein in vitro Gebärmutterhalskrebsmodell zu erstellen. Tumorzellen wurden als einzelne Zellen biogedruckt und dann erlaubt, Sphäroide zu bilden, die eine höhere Proliferationsrate, erhöhte Matrix-Metalloproteinase-Expression und eine höhere Chemoresistenz als Zellen in 2D-Kultur35zeigten. In diesen Studien wurden, wie in vielen anderen36,37, dissoziierte Zellsuspensionen biogedruckt, und dann wurden die Zellkulturen mit den erforderlichen mechanischen und biochemischen Hinweisen versehen, um den Zellen eine 3D-Struktur zu ermöglichen. Die zelluläre Selbstmontage kann jedoch Tage oder Wochen dauern, komplexe räumliche und zeitliche Umwelthinweise erfordern oder nicht auftreten, wenn zwei Zelltypen mitkultiviert werden. Zum Beispiel induzierten Brustepithelzellen den Zelltod in Endothelzellen in 2D-Kokultur, und dissoziierte Brustepithelzellen bildeten keine 3D-Spheroide, wenn sie in Alginat/Gelatine-Hydrogelen38bioprinted wurden. Dissoziierte Brustepithel- oder Krebszellen bildeten Sphäroide in Alginat-basierten Bioinks nur, wenn sie in kreisförmigen PDMS-Formen eingeschlossen waren. In anderen Fällen wurden Sphäroide mit hängenden Tröpfchen in ultraniedrigen Befestigungskreisplatten gebildet und dann in Alginat-basierte Bioinks39,40gemischt.
Wir beschreiben nun eine alternative 3D-Gewebebiomanufacturing-Methode in diesem Protokoll. Anstatt entfernt von Samen dissoziierte Zellen und warten, bis diese Zellen die 3D-Strukturen bilden, beschreiben wir, wie man 3D-Tumorsphäride in einem Gefäßröhrennetzwerk erstellt und bioprintt, um ein Tumor-Kokulturmodell zu erstellen, das fast sofort verwendet werden kann. Tumorsphäride können in vitro angebaut oder aus menschlichen Geweben (Organoiden) gewonnen werden. Ebenso können Gefäßröhren angebaut oder aus mikrovaskulären Fragmenten des Fettgewebes abgeleitet werden. Bioinks können von biologisch inaktivem Alginat bis zum hochbiologisch aktiven Matrigel41reichen. Da dieses 3D-Tumor-Cokulturmodell mit einer Vielzahl von Zellstrukturen und Bioinks erstellt werden kann, kann es mehrere Zelltypen, extrazelluläre Matrizen und Chemokin-Gradienten15,42integrieren. Während in ihrer aktuellen Formulierung die Endothelnetzwerke nicht durchdrungen werden können, könnten zukünftige Iterationen diese Methode mit Mikrofluiden oder -on-Chip-Systemen integrieren. Bioprinting 3D Brust epitheliale Sphäroide auf endotheliale Netzwerke ermöglicht eine schnelle Biofertigung von menschlichen Brustmodellen für Arzneimitteltests und personalisierte Präzisionsmedizin27.

<table><tbody><tr><td>37&amp;deg;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Cell incubation</td></tr><tr><td>3D Bio printer</td><td>custom-made</td><td>None</td><td>Used for bioprinting</td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>for seeding spheroids</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>bioprinting syringe needle</td></tr><tr><td>Absolute ethanol (200 proof )</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>reconsitution of media components</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&amp;prime;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>secondary block - Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Bovine insulin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blocking agent -Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Remove large or clustered spheroids</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;trade; Red CMTPX Dye</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>pre-stain for HUVEC tubes</td></tr><tr><td>Compact Centrifuge</td><td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td><td>Z206A</td><td>For cell centrifugations</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Conical tubes 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Collecting and resuspending cells</td></tr><tr><td>Countess II-FL Cell counter</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>counting cells</td></tr><tr><td>Glass pipettes (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>cell resuspension</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A basal media</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC basal media</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunofluorescence labelling component</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Nuclei stain immunofluorescence</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Media additive</td></tr><tr><td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td><td>Cell applications, San Diego , CA</td><td>200-05f</td><td>Endothelial cell lines</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td></tr><tr><td>Live Dead assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal microscope</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Used to visualize cells</td></tr><tr><td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Spheroid formation</td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Breast cell line</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>cell fixative</td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Wash buffer for cells before trypsinization</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>immunofluorescence mountant medium</td></tr><tr><td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ assay media component</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Sterile syringe (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>bioprinting process</td></tr><tr><td>Tissue culture dish (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>monolayer cell culture</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>cell counter additive</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>cell detachment</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>immunofluorescence buffer component</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth factor (VEGF&lt;sub&gt;165&lt;/sub&gt;)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC tube additive</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 cell imaging software</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z stack compresser</td></tr></tbody></table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting entwickelt sich zu einem vielversprechenden Werkzeug, um 3D-Humankrebsmodelle herzustellen, die kritische Merkmale der In-vivo-Gewebearchitektur besser rekapitulieren. Beim aktuellen Schicht-für-Schicht-Extrusionsbioprinting werden einzelne Zellen in einem Bioink zusammen mit komplexen räumlichen und zeitlichen Hinweisen extrudiert, um die hierarchische Gewebeselbstmontage zu fördern. Diese Biofabrikationstechnik beruht jedoch auf komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Bioinken und biochemischen und biophysikalischen Hinweisen. Daher kann die Selbstmontage Tage oder sogar Wochen dauern, kann bestimmte Bioinks erfordern und kann nicht immer auftreten, wenn mehr als ein Zelltyp beteiligt ist. Deshalb haben wir eine Technik entwickelt, um vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride in einer Vielzahl von Bioinks direkt zu bioprinten. Biobedruckte vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride hielten ihre Lebensfähigkeit aufrecht und polarisierten die Architektur nach dem Druck. Zusätzlich haben wir die 3D-Sphäroide auf vaskuläre Endothelzellnetzwerke gedruckt, um ein Co-Kultur-Modell zu erstellen. So schafft die neuartige Bioprinting-Technik schnell ein physiologisch relevanteres 3D-Brustmodell zu geringeren Kosten und mit einer höheren Flexibilität als herkömmliche Bioprinting-Techniken. Diese vielseitige Bioprinting-Technik kann extrapoliert werden, um 3D-Modelle anderer Gewebe in zusätzlichen Bioinks zu erstellen.

Brustepithelzellen sollten sich nach 5-8 Tagen Kultur auf Matrixlösung und im Kulturmedium mit 2% Matrixlösung selbst in 3D-Sphäroide organisieren. Nicht-tumorigene MCF10A Brustepithelialsphäride sollten rund erscheinen und ein hohles Zentrum haben, mit Integrin 6 polarisiert bis zum äußeren Rand des Sphäroids(Abbildung 1, Einschub zeigt Hohlzentren). Hochinvasive MDA-MB-231 Brustkrebs-Epithelzellen bilden unregelmäßige Sphäroide. Sphäroide sollten verwendet werden, wenn sie einen...

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Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.9K Aufrufe.  Drexel University. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Serie: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Forschung

Krebsforschung

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Biotechnik

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create tissues by adding layer upon layer of printable biomaterials, termed bioinks, and cells in an orderly and automatic manner, which allows for creating highly intricate structures that traditional tissue engineering techniques cannot achieve. Thus, 3D bioprinting is an appealing in vitro approach to mimic the native vasculature complex structure, ranging from millimetric vessels to microvascular networks. 
Advances in 3D bioprinting in granular hydrogels enabled the high-resolution extrusion of low-viscosity extracellular matrix-based bioinks. This work presents a combined 3D bioprinting and sacrificial mold-based 3D printing approach for fabricating engineered vascularized tissue flaps. 3D bioprinting of endothelial and support cells using recombinant collagen-methacrylate bioink within a gelatin support bath is utilized for the fabrication of a self-assembled capillary network. This printed microvasculature is assembled around a mesoscale vessel-like porous scaffold, fabricated using a sacrificial 3D printed mold, and is seeded with endothelial cells. 
This assembly induces the endothelium of the mesoscale vessel to anastomose with the surrounding capillary network, establishing a hierarchical vascular network within an engineered tissue flap. The engineered flap is then directly implanted by surgical anastomosis to a rat femoral artery using a cuff technique. The described methods can be expanded for the fabrication of various vascularized tissue flaps for use in reconstruction surgery and vascularization studies.

Engineered flaps require an incorporated functional vascular network. In this protocol, we present a method of fabricating a 3D printed tissue flap containing a hierarchical vascular network and its direct microsurgical anastomoses to rat femoral artery.

Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

<meta charset="utf8"></head><body>3D-Bioprinting für die schnelle Herstellung von Gefäßnetzwerken mit Gefäßen auf einer Platte

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in coronary arteries and impaired function of the blood-brain barrier. Existing fabrication techniques do not adequately replicate the geometrical variation in vascular networks in the human body, which substantially influences disease progression; moreover, these techniques often involve multi-step fabrication procedures that hinder the high-throughput production necessary for pharmacological testing. This paper presents a bioprinting protocol for creating multiple vascular tissues with desired patterns and sizes directly on standard six-well plates, overcoming existing resolution and productivity challenges in bioprinting technology. A simplified fabrication approach was established to construct six hollow, perfusable channels within a hydrogel, which were subsequently lined with human umbilical vein endothelial cells to form a functional and mature endothelium. The computer-controlled nature of 3D bioprinting ensures high reproducibility and requires fewer manual fabrication steps than traditional methods. This highlights VOP's potential as an efficient high-throughput platform for modeling vascular permeability and advancing drug discovery.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Automatisiertes Bioprinting für die Herstellung von Gefäßmodellen mit hohem Durchsatz

We present a protocol for high-throughput production of vascular channels with flexible sizes and desired patterns on a standard six-well plate using 3D bioprinting technology, referred to as vessels-on-a-plate (VOP). This platform has the potential to advance the development of therapeutics for the disorders associated with compromised endothelium.

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...