Diese Forschung wurde von NIH 1R01HL140239-01 an AMC finanziert. Wir bedanken uns beim Cell Imaging Center der Drexel University.

1. Brustepithelzellwachstum und Assay-Medien
<ol><li>MCF10A Brustepithelzellen HINWEIS: Die nicht-tumorigenic verewigte Brustepithelzelllinie wird von einem Patienten mit fibrozystischer Erkrankungabgeleitet 43. Zellen drücken keinen Östrogenrezeptor aus.<ol>
<li>Um den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) von 20 g/ml vorzubereiten, lösen Sie 100 g lyophilisierten EGF in 500 l sterilen dH2O auf, um 200 g/ml EGF zu bilden. Fügen Sie 500 l von 200 g/ml EGF in 4,5 ml sterile 0,1% BSA in dH2O hinzu, um eine EGF-Lagerlösung mit 20 sg/ml herzustellen. Vorbereitete 20 g/ml EGF-Aliquots bei -20 °C für bis zu 12 Monate lagern.</li>
		<li>Zur Zubereitung von 500 g/ml Hydrocortison 1 mg Hydrocortison in 1 ml absolutem Ethanol (200 Nachweis) verdünnen. Fügen Sie 1 ml steriles DMEM F:12 zu dieser Mischung hinzu, um eine 500 g/ml Hydrocortison-Stammlösung herzustellen. Hydrocortison-Lager-Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate lagern.</li>
		<li>Um 10 g/ml Choleratoxin vorzubereiten, lösen Sie 1 mg Choleratoxin lyophilisiertes Pulver in 1 ml sterilem dH2O auf, um eine 1 mg/ml Choleratoxin-Stammlösung herzustellen. Speichern Sie Cholera-Toxin-Lager Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate.</li>
		<li>Zur Vorbereitung des Wachstumsmediums werden 500 l EGF (20 g/ml), 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum. Die Antibiotikakonzentration wurde auf 2 % erhöht, um die verminderte Sterilität im Bioprinting-Prozess zu berücksichtigen; die Antibiotikakonzentration kann jedoch auf 1% gesenkt werden.</li>
		<li>Zur Vorbereitung von Assay Medium 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 HINWEIS: Die dreifach-negative (fehlende Östrogen-Rezeptor, Progesteron-Rezeptor, und epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2) Brustkrebs-Epithel-Zelllinie wird aus Pleuraerguss einer weiblichen Patientin mit metastasierendem Mamma-Adenokarzinom44erstellt. Zellen stellen einen aggressiven, invasiven und schlecht differenzierten Brustkrebs dar.<ol>
<li>Zur Vorbereitung von Growth and Assay Medium 50 ml fetales Rinderserum, 10 ml Penicillin und Streptomycin und 25 ml Pferdeserum zu 500 ml DMEM für eine Endkonzentration 10% v/v fetales Rinderserum, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Brustepithelzellkultur
<ol><li>Samen 500.000 MCF10A oder MDA-MB-231 Zellen in einer 10 cm (P100) Gewebekulturschale mit 10 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Wachstumsmedien. MCF10A- und MDA-MB-231-Zellen erreichen >90% Zusammenfluss in 48 Stunden.</li>
	<li>Um Brustepithelzellen zu durchziehen, waschen Sie zuerst Zellen mit 10 ml warmem PBS.</li>
	<li>Lösen Sie Brustepithelzellen, indem Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Schale geben. Legen Sie das Gericht in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 20-25 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie den Trypsinisierten Zellen 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen.</li>
	<li>Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium wieder aufsetzen.</li>
	<li>Platte 1 ml Zellsuspension in 5 neuen 10 cm Gewebekulturschalen zusammen mit MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Die Zellen können in 2-3 Tagen wieder durchgesieben werden. MCF10A-Zellen können bis zu Durchgang s 35 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen. MDA-MB-231-Zellen können bis Durchgang S24 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen.</li>
</ol>3. Brust epitheliale Sphäroid-Formation
<ol><li>Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (z. B. Matrigel) (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.</li>
	<li>Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.</li>
	<li>Inkubationskammergleitet in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um die Matrixlösung zu polymerisieren.</li>
	<li>Setzen Sie trypsinisierte MCF10A-Zellen in MCF10A Assay Medium bei 200.000 Zellen/ml aus oder setzen Sie trypsinisierte MDA-MB-231-Zellen in MDA-MB-231 Growth Medium bei 200.000 Zellen/ml wieder aus.</li>
	<li>Bei Verwendung von MCF10A-Zellen bereiten Sie frisches MCF10A Spheroid Growth Medium vor, indem Sie 5 l EGF (20 g/ml) und 100 l Matrixlösung zu 5 ml Assay Medium für eine Endkonzentration von 2% Matrixlösung hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie den mit Matrixlösung vorbeschichteten Kammerschlitten aus dem Inkubator. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L MCF10A oder MDA-MB-231 Zellsuspension (10.000 Zellen) hinzu. Wenn Sie MCF10A-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu. Wenn Sie MDA-MB-231-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MDA-MB-231 Growth Medium vorgemischt mit 2% Matrixlösung (9 l) hinzu. Stellen Sie die Kammerrutsche sofort in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium alle 4 vier Tage. Mit einer 200-L-Pipettenspitze aus einer Ecke jedes Brunnens heraus pipette 200 l alte Medien. Kippen Sie dabei den Kammerschlitten um 45°, um sicherzustellen, dass die Sphäroide nicht gestört werden. Fügen Sie 200 L frisch zubereitetes MCF10A Spheroid Growth Medium oder MDA-MB-231 Growth Medium, das zuvor mit 2% Matrixlösung gemischt wurde, zu jedem Brunnen an der Ecke in Tropfen hinzu, um sicherzustellen, dass Sphäroide an der Matrixschicht befestigt bleiben. Nur 50 % der Medien werden ersetzt, so dass alle zytokinen, die von den Sphäroiden produziert werden, nicht vollständig erschöpft sind. HINWEIS: MCF10A Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 8 Tage, um zu polarisieren und Hohlzentren zu bilden. MDA-MB-231 Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 5 Tage, um sich zu bilden und haben keine Hohlzentren.</li>
</ol>4. Endotheliale Zellnetzbildung
<ol><li>Human Umbilical Venin Endothelzelle (HUVEC) Kultur<ol>
<li>Fügen Sie den Inhalt eines einzigen Endotheliale Wachstums Medium-2-Kits hinzu, das Insulinwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor enthält, Ascorbinsäure, epidermaler Wachstumsfaktor, Heparin und Gentamicin-Amphotericin B, zusammen mit 50 ml fetalem Rinderserum, 5 ml Penicillin-Streptomycin und 5 ml 200 mM Glutamin bis 500 ml Endothelialebasal Medium-2 (EBM-2) zu einem vollständigen Endothel-Wachstumsmedium (EGM-2).</li>
		<li>Samen 500.000 Endothelzellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in 10 ml EGM-2. Legen Sie Zellen in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie >80% Konfluenz erreichen (ca. 48 Stunden).</li>
		<li>Um Zellen zu durchziehen, waschen Sie Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Überwachen Sie die Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie. Die Zellen sind bereit, wenn sie aufgeballt werden, bleiben aber an der Schale befestigt.</li>
		<li>Das Trypsin vorsichtig aus der Schale saugen. Fügen Sie 8 ml EGM-2 in das Gericht. Waschen Sie zellenvon der Schale, indem Sie den EGM-2 über die gesamte Telleroberfläche nach oben und unten pfeifen.</li>
		<li>Alternativ können Sie den Trypsin-Zellen 5 ml EGM-2 hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen. Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 10 ml EGM-2 wieder aufhängen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml Zellsuspension zu 9 ml EGM-2 in einer 10 cm Gewebekulturschale hinzu. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Tauschen Sie 2/3 des Mediums alle 2 Tage mit frischem EGM-2 um. Die Zellen können in 3-5 Tagen durchforsst werden. HUVEC kann bis Zugänge 8 aufrechterhalten werden, nach denen sie keine Netzwerke bilden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endothelzelle (HUVEC) Netzwerkbildung</li>
	<li>Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.</li>
	<li>Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.</li>
	<li>Inkubationskammer gleitet in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um Matrigel zu polymerisieren.<ol>
<li>Eine 10 cm große Schale HUVEC mit 10 l Rote-Zell-Tracker (1:1000) 30 Minuten in 37 °C, 5% CO2-Inkubator vorfärben.</li>
		<li>Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS waschen. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 5 Minuten, um die Zellen vollständig zu lösen.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml EGM-2 in die Schale, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 25 ml konisches Rohr. Zentrifuge HUVEC bei 1.200 x g für 5 Minuten. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 5 ml serumfreiem EBM-2 wieder aufhängen.</li>
		<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um lebensfähige Zellen zu bestimmen. Erstellen Sie eine 1 x 10 6-Zellen/ml-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie 100.000 HUVEC zu jedem Brunnen mit 200 L serumfreien EBM-2 hinzu. Wenn mehr Zellen hinzugefügt werden, erstellen sie eine Oberflächenmonolayer anstelle eines Rohrnetzwerks.</li>
		<li>HUVEC in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator inkubieren. Nach 6 Stunden, Bild HUVEC Netzwerke durch Phasenkontrastmikroskopie. Netzwerke sind jetzt bereit für die Kokultur mit Brustsphäroiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioprinting Brustepithelial sphäroide auf vorgeformten HUVEC-Netzwerken
HINWEIS: Für den Bioherstellungsprozess sollte ein Bio-Abscheidungssystem mit zwei Düsen verwendet werden. In diesem Fall verfügte das System über drei Bewegungsarme, um eine räumliche Kontrolle der Materialabscheidung im Mikronmaßstab zu ermöglichen, sowie über zwei schraubengetriebene Motoren, um Bioink aus 10 ml Spritzen abzulagern. Das System sollte mit einem hocheffizienten Partikelluftfiltrationssystem sowie UV-Sterilisationsfunktionen funktionalisiert werden, um eine sterile Umgebung während des Bioprintings zu erhalten. Der Bioprinter wird vor dem Druckvorgang eine Stunde lang UV-sterilisiert.
<ol><li>Erstellen Sie Brustepithelisaleroiide und HUVEC-Netzwerke, wie zuvor beschrieben. Schätzen Sie die Anzahl der Brustepithelialsphäroide in jedem Brunnen, indem Sie Sphäroide in repräsentativen Phasenkontrastmikroskopiebildern zählen.</li>
	<li>0,5 cm vom Ende einer 1000 L Pipettespitze abschneiden. Verwenden Sie die geschnittene Pipettenspitze, um alle Sphäroide aus dem 8-Well-Kammerschlitten und in ein 50 ml-Rohr sorgfältig zu pipette. Resuspend Sphäroide in der ausgewählten Bioink bei 100 Sphäroide/100 l. HINWEIS: Höhere Sphäroidkonzentrationen können zu Sphäroidclustering führen und die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen den Sphäroiden und den Endothelnetzwerken verhindern.</li>
	<li>Übergeben Sie die Sphäroidmischung durch ein 70-m-Zellsieb, um große oder gruppierte Sphäroide zu entfernen.</li>
	<li>Die gepoolten Sphäroide in eine 10 ml sterile Spritze geben und mit einer 25-Spur-Sterilnadel verschließen. Befestigen Sie die Spritze am Bio-Abscheidungssystem.</li>
	<li>Saugen Sie das Medium aus den HUVEC-Netzwerken in der 8-Well-Kammerrutsche.</li>
	<li>Extrudieren Sie 100 l Brustepithelialsphäride auf 6 Brunnen von HUVEC-Netzwerken mit einer Durchflussrate von 1 ml/min. Verwalten Sie 2 Brunnen von HUVEC-Netzwerken als Steuerungen.</li>
	<li>Fügen Sie 400 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu, wenn Sie MCF10A Sphäroide verwenden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt werden, oder 400 L MDA-MB-231 Growth Medium hinzufügen, das zuvor mit einer Matrixlösung von 2% gemischt wurde, wenn MDA-MB-231 Sphäroide verwendet werden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt wurden. Das jeweilige Sphäroid-Wachstumsmedium sollte in HUVEC-Kontrollbrunnen eingesetzt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie Kokulturen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 24 – 96 Stunden ohne Medienwechsel. Die Kokulturen werden im ursprünglichen Medium bis zu vier Tage lebensfähig bleiben.</li>
</ol>6. Konfokale Mikroskopie
<ol><li>Immunfluoreszenz und PBS-Glycin-Waschpuffer-Vorbereitung<ol>
<li>Vorbereiten Sie Immunofluoreszenz (IF) Puffer 10x Stammlösung durch Zugabe von 2,5 g Natriumazid, 5 g Rinderserumalbumin, 10 ml Triton X-100 und 2,05 ml Tween-20 in 500 ml 10x PBS. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu einem Jahr bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie einen funktionierenden IF-Puffer, indem Sie 50 ml 10x IF-Puffer in 450 ml sterilen entionisiertem Wasser verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei Raumtemperatur auf.</li>
		<li>Bereiten Sie 10x PBS-Glycin-Puffer-Lagerlösung vor, indem Sie 37,5 g Glycin zu 500 ml 10x PBS hinzufügen. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu 6 Monate bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie eine funktionierende PBS-Glycin-Lösung, indem Sie 50 ml 10x PBS-Glycin-Puffer in 450 ml sterilen entionisierten Wassers verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei 4 °C auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label Bioprinted Samples and Image by Confocal Microscopy<ol>
<li>Aspirieren Sie Medium aus bioprinted 3D-Kokulturen und spülen Sie 3 mal mit warmen PBS. Fix bioprinted 3D Kokulturen mit 4% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur. Proben 3 mal für 20 Minuten mit 1x PBS-Glycin emiten.</li>
		<li>Blockproben mit IF-Puffer gemischt mit 10% Ziegenserum für 90 Minuten (Primärblock), gefolgt von 40 Minuten mit IF-Puffer plus 10% Ziegenserum und Affinipure Fab Fragment (1:100, Sekundärblock).</li>
		<li>Bei Verwendung von MCF10A-Sphäroiden proben mit einem Primärantikörper für Integrin 6 (1:100) im sekundären Sperrpuffer über Nacht bei 4 °C, gefolgt von einem Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1:200) und Hoescht 33342 (1:1000) für 1 h bei lichtgeschützter Raumtemperatur. MCF10A-Zelllinien drücken hohe Integrin-Konzentrationen aus 6, die für die Darstellung der Sphäroidpolarisation und Morphologie unerlässlich sind.</li>
		<li>Bei Verwendung von MDA-MB-231 Sphäroiden, die niedrige Integrin-Konzentrationen ausdrücken, beschriften Sie Proben mit Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) und Hoescht 33342 (1:1000) im sekundären Sperrpuffer für 4 Stunden bei Lichtschutz. Phalloidin ermöglicht die Visualisierung von Actin-Filamenten, so dass die amorphe und invasive Morphologie des Sphäroids beurteilt werden kann.</li>
		<li>Proben mit 1X PBS-Glycin 3 mal für 20 Minuten waschen.</li>
		<li>Bereiten Sie Proben für die Montage vor, indem Sie den Kammerschlitten mit dem Werkzeug des Herstellers entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen kleinen Tropfen Antifade-Lösung hinzu. Legen Sie einen 22 mm x 60 mm Abdeckzettel auf jeden Kammerschlitten und versiegeln Sie die Kanten sorgfältig mit klarem Nagellack.</li>
		<li>Bildproben mit einem konfokalen Mikroskop als Z-Stacks von 10 Scheiben in 5'm Schritten. Komprimieren Sie zkomprimiert z.B. mit dem Befehl Extended Focus in der Zellbildsoftware in eine einzelne Ebene.</li>
		<li>Quantify spheroid adheoid ad image J. Die Anzahl der haftenden Sphäroide kann mit dem Analyse-Plugin mit der entsprechenden Partikelgröße und Zirkularität quantifiziert werden. Normalisieren Sie die Anzahl der angefügten Sphäroide im Bildbereich.</li>
		<li>Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, quantifizieren Sie die Anzahl der haftenden Sphäroide in 4 x 4 gefliesten Bildern von Kokulturen. Wenn die Sphäroidzahl statistisch signifikant niedriger ist als bei anderen Experimenten, sollte das Experiment wiederholt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Sphäroide in ihrer 3D-Architektur für die Co-Kultur mit Endothelzellen auch in ihrer 3D-Architektur bioprintiert. Kritische Protokollschritte umfassen die Erstbildung von Brustepithelialsphäroiden und HUVEC-Netzwerken. Bei der Fütterung von Epithelsphäroiden ist äußerste Vorsicht geboten, da sie leicht von der Matrixlösung gestört werden können. Ebenso müssen Brustepithelilesphäroide mit Vorsicht behandelt werden, wenn sie von der Matrixlösung abgeführt und in ...

3D-in-vitro-vaskularisierte Tumormodelle sind wesentliche Werkzeuge für die mechanistische Untersuchung von Krebswachstum und Metastasen. Insbesondere bei Brustkrebs organisieren sich in Matrigel kultivierte Brustepithelzellen zu polarisierten Sphäroiden, die eher der in vivo-Mamma-Akuinusarchitektur1,2,3,4,5,6,7,8ähneln. 3D-Brustepithelzellkultur wirkt sich auch auf die Zellfunktion aus, wobei 3D-KulturenUnterschiede in der epidermalen Wachstumsfaktor-Modulation (EGF) zeigen 8,9; Onkogenfunktion, einschließlich ErbB210; Wachstum und Apoptose-Signalisierung11,12; und Chemotherapie-Resistenz13,14. Vaskuläre Endothelzellen reagieren ähnlich unterschiedlich auf Umweltreize in 3D im Vergleich zu traditioneller 2D-Kultur15,16,17,18. Ein Großteil des Verständnisses von vaskulären endotheliale und Brustepithel-Wechselwirkungen stammt jedoch aus der 2D-Kultur mit konditionierten Medium- oder Transwell-Einsätzen oder 3D-Modellen, bei denen die beiden Zelltypen physisch getrennt sind19,20,21,22,23. Diese Co-Kultur-Modelle bieten begrenzte physiologische Erkenntnisse, da sowohl 3D-Kultur als auch Zellzellkontakt entscheidend für vaskuläre endotheliale – Brustepithelzellinteraktionen24,25,26sind.
3D-Krebsmodelle wurden mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, einschließlich hängender Tropfensphäroidbildung, Bioprinting, magnetische Montage und Kultur in Hydrogelen oder auf technischen Gerüsten5,27,28,29. In jüngerer Zeit wurden 3D-Tumormodelle mit mehreren Zelltypen erstellt, die in ihren jeweiligen 3D-Strukturen angeordnet sind. In einem Beispiel einer Tumor-on-a-Chip-Plattform wurden Krebs-, Endothel- und Stromalzellen in eine Matrix gemischt und dann in die drei zentralen Gewebekammern in einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Gerät injiziert. Die Gewebekammern wurden von zwei äußeren Kanälen umrandet, die eine Arterie und Venule darstellten. Nach 5-7 Tagen Kultur bildeten Endothelzellen ein mikrovaskuläres Netzwerk und Krebszellen vermehrten sich zu kleinen Tumoren in der Nähe der Vaskulatur. Diese Plattform wurde dann verwendet, um Drogen und Drogenkombinationen zu überprüfen30. Zusätzliche Tumor-on-a-Chip-Plattformen wurden geschaffen, um Metastasen und Krebsarten mit spezifischen mechanischen Reizen (z.B. mechanische Dehnung in der Lunge) zu untersuchen31,32. Diese Plattformen enthalten jedoch in der Regel nicht sowohl Vaskulatur als auch Krebs in ihren jeweiligen 3D-Strukturen.
Die Biofertigung ist vielversprechend bei der Weiterentwicklung von 3D-in-vitro-vaskularisierten Tumormodellen, da sie eine enge räumliche Kontrolle über die Zelllage ermöglicht. Trotz des Wachstums des Bioprinting in den letzten zehn Jahren konzentrieren sich nur wenige Studien speziell auf Tumore33,34. In einem Beispiel wurde der 3D-Druck von HeLa-Zellen in einem Gelatine-/Alginat-/Fibrinogen-Hydrogel verwendet, um ein in vitro Gebärmutterhalskrebsmodell zu erstellen. Tumorzellen wurden als einzelne Zellen biogedruckt und dann erlaubt, Sphäroide zu bilden, die eine höhere Proliferationsrate, erhöhte Matrix-Metalloproteinase-Expression und eine höhere Chemoresistenz als Zellen in 2D-Kultur35zeigten. In diesen Studien wurden, wie in vielen anderen36,37, dissoziierte Zellsuspensionen biogedruckt, und dann wurden die Zellkulturen mit den erforderlichen mechanischen und biochemischen Hinweisen versehen, um den Zellen eine 3D-Struktur zu ermöglichen. Die zelluläre Selbstmontage kann jedoch Tage oder Wochen dauern, komplexe räumliche und zeitliche Umwelthinweise erfordern oder nicht auftreten, wenn zwei Zelltypen mitkultiviert werden. Zum Beispiel induzierten Brustepithelzellen den Zelltod in Endothelzellen in 2D-Kokultur, und dissoziierte Brustepithelzellen bildeten keine 3D-Spheroide, wenn sie in Alginat/Gelatine-Hydrogelen38bioprinted wurden. Dissoziierte Brustepithel- oder Krebszellen bildeten Sphäroide in Alginat-basierten Bioinks nur, wenn sie in kreisförmigen PDMS-Formen eingeschlossen waren. In anderen Fällen wurden Sphäroide mit hängenden Tröpfchen in ultraniedrigen Befestigungskreisplatten gebildet und dann in Alginat-basierte Bioinks39,40gemischt.
Wir beschreiben nun eine alternative 3D-Gewebebiomanufacturing-Methode in diesem Protokoll. Anstatt entfernt von Samen dissoziierte Zellen und warten, bis diese Zellen die 3D-Strukturen bilden, beschreiben wir, wie man 3D-Tumorsphäride in einem Gefäßröhrennetzwerk erstellt und bioprintt, um ein Tumor-Kokulturmodell zu erstellen, das fast sofort verwendet werden kann. Tumorsphäride können in vitro angebaut oder aus menschlichen Geweben (Organoiden) gewonnen werden. Ebenso können Gefäßröhren angebaut oder aus mikrovaskulären Fragmenten des Fettgewebes abgeleitet werden. Bioinks können von biologisch inaktivem Alginat bis zum hochbiologisch aktiven Matrigel41reichen. Da dieses 3D-Tumor-Cokulturmodell mit einer Vielzahl von Zellstrukturen und Bioinks erstellt werden kann, kann es mehrere Zelltypen, extrazelluläre Matrizen und Chemokin-Gradienten15,42integrieren. Während in ihrer aktuellen Formulierung die Endothelnetzwerke nicht durchdrungen werden können, könnten zukünftige Iterationen diese Methode mit Mikrofluiden oder -on-Chip-Systemen integrieren. Bioprinting 3D Brust epitheliale Sphäroide auf endotheliale Netzwerke ermöglicht eine schnelle Biofertigung von menschlichen Brustmodellen für Arzneimitteltests und personalisierte Präzisionsmedizin27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator, 5% CO2 and 95% humidity</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-20AIC</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Bio printer</td>
			<td>custom-made</td>
			<td>None</td>
			<td>Used for bioprinting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>53106-306</td>
			<td>for seeding spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>Z192406-100EA</td>
			<td>bioprinting syringe needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (200 proof )</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>reconsitution of media components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinipure F(ab&#8242;)2 fragment goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td>115006020</td>
			<td>secondary block - Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Seconday antibody-Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine insulin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>I-035-0.5ML</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>A2153-500G</td>
			<td>Blocking agent -Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>352350</td>
			<td>Remove large or clustered spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker&#8482; Red CMTPX Dye</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>pre-stain for HUVEC tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Centrifuge</td>
			<td>Hermle- Labnet, Edison ,NJ</td>
			<td>Z206A</td>
			<td>For cell centrifugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>C8052-.5MG</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>62406-200</td>
			<td>Collecting and resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II-FL Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>76184-746</td>
			<td>cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F:12</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>11320033</td>
			<td>MCF10A basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 1X</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td>MDA-MB-231 basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td>HUVEC basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td>
			<td>Lonza, Durham, NC</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#8482; 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Labelling MDA-MB-231 spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Cytiva, Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>HUVEC/MDA-MB-231 media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>G8898-500G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>62249</td>
			<td>Nuclei stain immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>16050130</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>H0888-5G</td>
			<td>MCF10A Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Cell applications, San Diego , CA</td>
			<td>200-05f</td>
			<td>Endothelial cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin &#945;6</td>
			<td>Millipore, Billerica, MA</td>
			<td>MAB1378</td>
			<td>Immunofluorescence spheroid labelling component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Dead assay</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Live and dead cell stain assay for cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, Thornwood, NY</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>354230</td>
			<td>Spheroid formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td>Breast cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td>cell fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1X (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>7001106</td>
			<td>Wash buffer for cells before trypsinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline 10X</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>P36934</td>
			<td>immunofluorescence mountant medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>MCF10A/ assay media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe (10 mL)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>75846-757</td>
			<td>bioprinting process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (10cm)</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>monolayer cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma, St.Louis, MO</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell counter additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td>cell detachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween -20</td>
			<td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td>
			<td>85113</td>
			<td>immunofluorescence buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165)</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td>
			<td>100-20</td>
			<td>HUVEC tube additive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3 cell imaging software</td>
			<td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td>Z stack compresser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct bioprinting of 3d multicellular breast spheroids onto endothelial networks

Bioprinting entwickelt sich zu einem vielversprechenden Werkzeug, um 3D-Humankrebsmodelle herzustellen, die kritische Merkmale der In-vivo-Gewebearchitektur besser rekapitulieren. Beim aktuellen Schicht-für-Schicht-Extrusionsbioprinting werden einzelne Zellen in einem Bioink zusammen mit komplexen räumlichen und zeitlichen Hinweisen extrudiert, um die hierarchische Gewebeselbstmontage zu fördern. Diese Biofabrikationstechnik beruht jedoch auf komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Bioinken und biochemischen und biophysikalischen Hinweisen. Daher kann die Selbstmontage Tage oder sogar Wochen dauern, kann bestimmte Bioinks erfordern und kann nicht immer auftreten, wenn mehr als ein Zelltyp beteiligt ist. Deshalb haben wir eine Technik entwickelt, um vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride in einer Vielzahl von Bioinks direkt zu bioprinten. Biobedruckte vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride hielten ihre Lebensfähigkeit aufrecht und polarisierten die Architektur nach dem Druck. Zusätzlich haben wir die 3D-Sphäroide auf vaskuläre Endothelzellnetzwerke gedruckt, um ein Co-Kultur-Modell zu erstellen. So schafft die neuartige Bioprinting-Technik schnell ein physiologisch relevanteres 3D-Brustmodell zu geringeren Kosten und mit einer höheren Flexibilität als herkömmliche Bioprinting-Techniken. Diese vielseitige Bioprinting-Technik kann extrapoliert werden, um 3D-Modelle anderer Gewebe in zusätzlichen Bioinks zu erstellen.

Brustepithelzellen sollten sich nach 5-8 Tagen Kultur auf Matrixlösung und im Kulturmedium mit 2% Matrixlösung selbst in 3D-Sphäroide organisieren. Nicht-tumorigene MCF10A Brustepithelialsphäride sollten rund erscheinen und ein hohles Zentrum haben, mit Integrin 6 polarisiert bis zum äußeren Rand des Sphäroids(Abbildung 1, Einschub zeigt Hohlzentren). Hochinvasive MDA-MB-231 Brustkrebs-Epithelzellen bilden unregelmäßige Sphäroide. Sphäroide sollten verwendet werden, wenn sie einen...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks at JoVE.com

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.8K Aufrufe.  Drexel University. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Serie: Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Forschung

Biotechnik

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with poor clinical outcomes and currently lacks effective treatment. Both the three-dimensional (3D) environment and the dynamic mechanical forces are very important factors in this metastatic cascade. However, traditional cell cultures fail to recapitulate this natural tumor microenvironment. Thus, in vivo-like models that can emulate the intraperitoneal environment are of obvious importance. In this study, a new microfluidic platform of the peritoneum was set up to mimic the situation of ovarian cancer spheroids in the peritoneal cavity during metastasis. Ovarian cancer spheroids generated under a non-adherent condition were cultured in microfluidic channels coated with peritoneal mesothelial cells subjected to physiologically relevant shear stress. In summary, this dynamic 3D ovarian cancer-mesothelium microfluidic platform can provide new knowledge on basic cancer biology and serve as a platform for potential drug screening and development.

To study ovarian tumor progression in a physiologically relevant model, multicellular spheroids were cultured in a microdevice under simulated fluid flow. This dynamic 3D model emulates the intraperitoneal environment with the cellular and mechanical components where ovarian cancer metastasis occurs.

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the living body than two-dimensional cell culture. In this study, we fabricated an electrical motor-driven lab-on-a-CD (compact disc) platform, called a centrifugal microfluidic-based spheroid (CMS) culture system, to create three-dimensional (3D) cell spheroids implementing high centrifugal force. This device can vary rotation speeds to generate gravity conditions from 1 x g to 521 x g. The CMS system is 6 cm in diameter, has one hundred 400 &#956;m microwells, and is made by molding with polydimethylsiloxane in a polycarbonate mold premade by a computer numerical control machine. A barrier wall at the channel entrance of the CMS system uses centrifugal force to spread cells evenly inside the chip. At the end of the channel, there is a slide region that allows the cells to enter the microwells. As a demonstration, spheroids were generated by monoculture and coculture of human adipose-derived stem cells and human lung fibroblasts under high gravity conditions using the system. The CMS system used a simple operation scheme to produce coculture spheroids of various structures of concentric, Janus, and sandwich. The CMS system will be useful in cell biology and tissue engineering studies that require spheroids and organoid culture of single or multiple cell types.

We present a motor-powered centrifugal microfluidic device that can cultivate cell spheroids. Using this device, spheroids of single or multiple cell types could be easily cocultured under high gravity conditions.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Großflächige, automatisierte Produktion von aus Fett gewonnenen Stammzellsphäroiden für den 3D-Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Photoabstimmbare biogedruckte Hydrogele zur Untersuchung zellulärer Reaktionen auf ECM-Versteifung

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

Autor im Rampenlicht: Chronische Lungenerkrankungen mit 3D-gedruckten phototunablen Hydrogelen verstehen 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...