Yazarları, teknik yardım için Organotipik kültürleri ve U. Laub ve U. Gerster kuruluşu ile E. de la Rosa ve AI Valenciano ilk yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm ekipman ve reaktifler steril satın alınacak ya da ısı veya buharla sterilize veya% 70 ETOH ile sterilize edilmiş olması gerekir. Hayvanlar üzerinde yapılan deneylerde, hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili deneysel prosedürleri ve Kurumsal Hayvan tarafından belirlenen düzenlemelere NIH Rehberi ardından, Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi (86/609/EEC) uygun olarak yapıldığını ve bu yazarlar Bakım ve Duisburg-Essen Üniversitesi (Almanya) Komitesi (IACUC) kullanın. Bölüm 1: farklı gelişim evreleri fare gözleri Enükleasyon Embriyonik gözleri, enükleasyon <ol><li> Zaman hamile çiftleşmelerin kadar vajinal fiş kadın çiftleşme tespit edildiği günün sabah ve gebeliğin gün 0 belirlenmiş. </li><li> Ve sabit bir balmumu tahta 6: embriyo gelişimi istenilen aşamada (embriyonik gün (E) 15) ulaşmıştır zaman hamile kadın servikal dislokasyon ile sakrifiye. </li><li> Karın duvarı orta hat boyunca kesilir ve cilt flep Pin 6 yanal sabit% 70 ETOH ile ıslatılır. </li><li> Uterusses karın, soğuk PBS 6 ile müstakil ve bir behere aktarılır kaldırılır. </li><li> Embriyolar, ayrılmış bir Petri kabı ve rahim duvarına aktarılır ve embriyonik membranlar, forseps 6 kullanımı ile dikkatlice çıkarılır . </li><li> Embriyolar dekapitasyon tarafından öldürüldü. </li><li> Göz, göz soketten gözleri &quot;soyma&quot;, ince, kavisli bir forseps kullanımı enükleasyon. </li></ol> Postnatal ve yetişkin gözler, Enükleasyon <ol start="1" type="1"><li> Genç yavrular servikal dislokasyon dekapitasyon, büyük yavrular ve yetişkinler tarafından öldürüldü. </li><li> Doğum sonrası sahne P15, fareler gözleri açık bir zaman noktasında, göz yarıklar mekanik forseps kullanımı tarafından açılan ve iki yaylı makas ile göz kapaklarını enine kesimler tarafından büyütülmüş olması var. </li><li> Gözler yörüngesine basınç uygulayarak, kavisli bir forseps yardımı ile enükleasyon. </li></ol> Not: orbital kemikler hala kıkırdak postnatal günde 2 itibariyle, gözleri kaldırmak için çalışırken çok fazla baskı uygulamak için önemlidir. Buna karşılık, yetişkin farelerde, orbital kemikler firma vardır. Böylece, gözleri aydınlatmak amacıyla, önceden göz yarıklar büyütme olmadan yörüngesine baskı uygulamak için yeterli olacaktır. Bölüm 2: embriyonik, doğum sonrası ve yetişkin fare retina Diseksiyon Retina, diseksiyonu <ol><li> Gözler steril PBS ve çevresindeki göz katmanları bir diseksiyon mikroskobu altında kaldırılır küçük bir Petri kabındaki yerleştirilir. </li><li> Doğum sonrası aşamaları ve optik sinir temelinde mümkün olduğunca yakın olarak forseps, yaylı makas veya sıkışmak kapalı yardımı ile kesilmek üzere yetişkin gözleri, dış göz tabakaları kaldırmak için. </li><li> Göz, optik sinir başlangıçta ikamet delik arka tarafı size bakacak şekilde çevirin. Retina ve pigment epiteli arasında çok ince optik sinir göz katmanlarına nüfuz sitesinden iki forseps ipuçları ile subretinal boşluk girin. Not: Genellikle koyu renk pigment epitel kolayca tespit edilebilir. Özellikle albino hayvanlar - bazı fare mutant Ancak bu pigment tabakasının renkli olmayabilir ve bu nedenle tespit etmek kolay olmayabilir. </li><li> Bağlı koroid membran ve sklera ile pigment epitel hem forseps ile her iki tarafında dikkatle yırtarak çıkartın. </li><li> Diğer forseps kalan retina kupasını tutarken, korneanın seviyesine katmanları soyun, sonra göz fincan lens tarafına çevirin ve pigment epitel, koroid membran ve sklera ile birlikte kornea kaldırmak. </li><li> Küçük bir objektif ile birlikte vitreus kavrayın ve forseps ile yırtılma ederken, ikinci forseps ile retina wholemount tutmak. Not: embriyonik gözleri diseksiyon, tamamen vitreus ile birlikte vitreus altındaki üçgen, çadır gibi kapiller pleksus kaldırmak için emin olun. Yetişkin gözü, vitreus kenarlarında kavradı gereken ve bakım içeriği kaldırılmasını engelleyen, forseps viskoz ve sopalarla olarak forseps ipuçları ile delmek vitreus alınmalıdır. </li><li> Organotipik wholemount kültürü için retina bardak 200 ul Dulbecco&#39;nun modifiye kartal orta (aşağıya bakın) içeren bir 96-plaka toplanır. </li></ol> Not: bireysel retina diseksiyonu arasında, kültür ortamı pH inkübatörde 96-iyi bir kültür ortamı içeren koleksiyon plaka karbonat sistemi yoluyla CO 2 tarafından tetiklenir . Bölüm 3: murin Organotipik retina wholemountkültür <ol><li> Ağırlık 7.8g Dulbecco&#39;nun modifiye kartal orta / besin karışımı F-12 HAM (DMEM) ve 0.6 NaHCO 3 ve MiIliQ suda hem erime 500 ml kültür hazırlayın. 7.15 pH ayarlayın. Kaputun altında, 2.5 ml gentamicine (200 mM), 50μl sodyum selenit (stok:: 52μg/ml), progesteron (60μg/ml stok): 50mg apo-transferin 50μl pütresin (60mg/ml hisse senedi) ekleyin. Mix ve bir şişe üst filtre süzülmeye. Kullanımı ml kültür ortamı başına 10μl glutamin (200 mM) hemen önce. Not: Bu serum ve insülin-orta, insülin dengeleyerek 2 haftaya kadar 4 ° C&#39;de saklanır ve apoptozis indüksiyonu deneyleri için kullanılan olabilir. 24 saat daha uzun süre boyunca wholemounts inkübasyon istenilen hücre ölüm oranları değerlendirmeye alınmayacaktır, insülin serum (örneğin fetal buzağı serumu; FCS) veya takviye sağkalım oranlarını artırmak için ilave edilmelidir. </li><li> Kültür başlamadan önce, retina wholemounts 37 az 15 dakika önceden inkübe edilir ° C, M Müller glia iç ve dış sınırlayıcı membran içeren hiyalüronidaz ön sindirimi 0.5mg/ml hiyalüronidaz içeren 200 ul sıcak, pH dengeli DMEM hücreleri, Eksojen olarak uygulanan maddelerin penetrasyonu kolaylaştırıcı. </li><li> Retinanın 2ml kimyasal olarak tanımlanmış Dulbecco&#39;nun modifiye kartal orta Organotipik wholemounts olarak kültür ve mümkün olduğunca az hiyalüronidaz 24 plaka aktarılır. Not: retina aktarmak için, 1 ml pipet kullanın ve açılış genişletmek için pipet ucu birkaç milimetre kesmek. Embriyonik gözler için, 200 ul pipet ucu yeterlidir. Kesicilere ikinci bir pipet ucu ekleme ve büküm tarafından düzeltilir olmalıdır. 24-48 saat kısa vadeli kültürleri için tüm adımları tezgah yapılabilir, ancak kültürlerin kirlenmesini bir sorun ortaya çıkarsa, bir başlık altında çalışması gerekir. </li><li> , 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 atmosfer 48 saat ve rekombinant faktörler ile farmakolojik tedavi tabi örneğin - Kültürler 24 saat süreyle korunur . </li></ol> Bölüm 4: kültürlü retina wholemounts Ayrılma <ol><li> Istenilen kültür bir süre sonra, retina 850 ul PBS ve 50 ul sığır serum albümin (30 mg / ml BSA) içeren yuvarlak alt 2ml Eppendorf tüpleri toplanır. </li><li> Eppendorf tüpleri, retina ile 37 kadar ısıtılmış bir ısıtma bloğu ° C. içine yerleştirin </li><li> Her Eppendorf tüpüne 25 ul kollajenaz (200 U / ml) ve 25 ul hiyalüronidaz (20mg/ml) ekleyin ve bir silikonlu Pasteur pipeti ile 3 geçer tek hücre süspansiyonu retina dissociating başlatmak. </li><li> 10 ul tripsin (1mg/ml) ekleyin, 3-5 dakika bekleyin ve sonra yavaş yavaş mekanik doku ayırmak silikonlu Pasteur pipeti ile 3-5 kez pipet ve. </li><li> 10 ul DNaz I (5mg/ml) ekleyin, yine 3-5 dakika sonra yavaş yavaş aşağı silikonlu Pasteur pipeti ile 3-5 kez pipet ve bekleyin. Not: enzimatik ayrılma inkübasyon süresi, gözleri ve gelişimsel aşamada büyüklüğü sırasıyla değişir ve bağlıdır. Hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve doku enzimatik sindirim aşamasında kontrol edin. </li><li> Hücre süspansiyonu artık homojen değil ama hala büyük hücre agrega içeren, ek 10 ul tripsin ve 10 ul DNaz I. eklemek </li><li> Hücre süspansiyonu homojen olduğunda, doku sindirim ek 10 ul EDTA (0.5 M) tarafından durdurulur, Eppendorf tüpleri, ısıtıcı ve hücre süspansiyonları kaldırılır 1ml taze, buz gibi% 8 paraformaldehid ek 1s için sabit (PFA) bir dönme çalkalayıcı oda sıcaklığında. </li></ol> Bölüm 5: ayrışmış hücre süspansiyonları Yıkama <ol><li> Hücre süspansiyonu ° C ile 0.2 RCF soğutma santrifüj 4 5 dakika santrifüj edilir. </li><li> Süpernatant atılır ve pelet 1ml PBS içeren 3mg/ml BSA yeniden askıya alınır. </li><li> Bu yıkama adımları iki kez tekrarladıktan sonra, pelet sonunda 500 ul PBS içeren 3mg/ml BSA, 5mM EDTA ve% 0.1 sodyum azid yeniden askıya alınır. </li></ol> Not: Ayrıca sodyum asit, birkaç gün, 4 ° C hücre süspansiyonu saklanmasına izin Ancak, bir immünositokimyasal boyama takip edersen, boyama kalitesi kaybı bu sonucu olarak, tabanda tampon sodyum asit eklemek yok. Bölüm 6: kantitatif apoptozis ve proliferasyon analizi için hücre süspansiyonları sitospin <ol><li> Bir veya iki delik ve sitospin huni ile bir buzlu uç mikroskop lamı, sitospin filtre bir sitospin slayt klip içine eklenir. Slayt klip kapalı ve sitospin rotor konumlandırılmış. </li><li> Ayrışmış hücre süspansiyonu hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve homojenize edilir. Not: retinanın gelişim aşamasına bağlı olarak, ayrışma prosedürü hücre süspansiyonu gerekebilirsayılabilen bir hücre numarası almak için PBS ile sulandırılmış. </li><li> Hücre süspansiyonu (100 ul) bir kısım, bir sitospin huni uygulanır. Not: huni hücre süspansiyonu pipetleme, pipet ucu huni alt tüm şekilde aşağı ulaştırılması gerekmektedir. Sitospin sonra hücre noktada görünür olacak hava kabarcıkları oluşturur ve hücre sayımı engellemektedir pipet ikinci basınç noktası üzerinden itmek için önemlidir. </li><li> 700 rpm&#39;de 7 dakika süreyle bir slayt hücre süspansiyonu damlatılır. </li><li> Apoptozis seviyelerde Eksojen olarak uygulanan faktörlerin etkisinin belirlenmesi için hücreler 4 ile boyanarak olabilir &#39;,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 2μg/ml), floresan montaj orta monte edilmiş. Sitospin hücre noktalar (en az 10 pycnotic çekirdekleri oluşan) en az 1000 hücre sayımı ve hücre ölümü oranı toplam hücre yüzdesi olarak hesaplanan 3,4 sayar hücre apoptozis değişiklikler tespit edilebilir. Not: Alternatif olarak, kültür retina wholemounts flatmounts 3 veya Kriyostat sections4 apoptotik çekirdeğinin dağıtım TdT aracılı dUTP nick sonuna etiketleme (TUNEL) tarafından değerlendirilmelidir. </li><li> Hücre proliferasyonunu tespiti için, BrdU (5 mcM) kültür ve BrdU dahil sonundan önce 6h immünositokimyasal boyama ile bir anti-BrdU antikoru (örneğin Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa, ABD) kullanılarak hücre homojenatlarında cytospins görselleştirilemediği eklenebilir. </li><li> Farklı retinal hücre tipleri tedavi etkisi Brn3a (ganglion hücre belirteci) veya opsin (fotoreseptör işaretleyici) ve DAPI ile counterstaining gibi nöron spesifik antikorların cytospins görüntülenebilmekte. </li></ol> Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: fare Organotipik retina wholemounts hazırlanması Adımlar Her iki gözü ile fare Başkanı lens yüzü B murin göz, tüm katmanları hala yerinde. C optik sinir arka murin gözü hâlâ bağlı D murin göz sklera ve pigment epitel kısmen kaldırıldı. E murin retinanın kornea, sklera ve pigment epitel tamamen kaldırıldı, ancak hala yerinde lens ve vitreus F lens ve vitreus ile retina murin wholemount fincan kaldırıldı. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: sitospin ve bölümleri Organotipik retina wholemount kültür analizi Apopitoz analizi için, ayrışmış hücre süspansiyonları cytospins DAPI ile boyanmış ve pycnotic çekirdekleri (A ok başları), nükleer parçalanma veya kromatin yoğunlaşması ile ayırt edilebilir . Alternatif olarak, wholemount bölümler (CE, fare retina postnatal gün (P) 2) veya (F) retina flatmount TUNEL assay ve DAPI (E) ile zıt olabilir. Farklı retinal hücre tipleri tedavi etkisi cytospins ganglion hücre belirteci Brn3a (B oklar) gibi nöron spesifik antikorlar tarafından görüntülenebilmekte GCL, ganglion hücre tabakası;. INL, ileriye dönük iç nükleer tabaka. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

Disosiasyon, tek tabaka üzerinde fare Organotipik retina wholemount kültürleri 2-5, retinospheroid veya yeniden toplanan 3D sfero kültürlerin korunması nöronal etkileşimleri ve bağlantıları 1 yalan, avantaj in vivo durumu taklit. Eski raporlar 2 karşılaştırıldığında, video makalede, lens ve vitreus retina zarar vermeden kaldırılması da dahil olmak üzere farklı gelişim evreleri retina fare gözleri ve diseksiyon enükleasyon özellikleri ayrıntılı bir ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Genler ve hayvan modellerinde analiz Hedeflenen ablasyonların kayıt yaptıran özel retina gen fonksiyonu için klasik bir strateji. Ancak, transgenik, retina özel veya koşullu nakavt fare modelleri genellikle erken öldürücülüğü görüntülemek veya embriyonik ya da erken doğum sonrası aşamalarında ötesinde bir analiz önlemede ciddi malformasyonlar muzdarip. Primer hücre kültürü Eksojen olarak uygulanan rekombinant faktörler, gen ya da kontrollü bir ortamda siRNA-aracılı gen demonte aşırı ekspresyonu etkilerini araştırmak için bir alternatiftir. Disosiye hücre kültürü, böylece, farmakolojik manipülasyon sonra eksojen tetiklenen etkileri kimlik kolaylaştırmak, hedef hücreleri ulaşan endojen sinyalleri azalır avantajı vardır. Ancak, önemli hücre-hücre etkileşimleri başlangıçta yeniden toplanan retinospheroid kültürler 1 kullanılsa bile, enzimatik sindirim veya mekanik ayrılma tarafından yok edilir. Buna karşılık, Organotipik retina wholemount kültürler nöronal etkileşimleri ve bağlantıları hala korunmuş 2-5 in vivo durum fizyolojik yakın bir sistem sağlar . Bu video makalede, postnatal embriyonik ve yetişkin fare gözleri diseksiyonu özellikleri ve nöronal analizi (2) bölünmeler ve sitospin prosedürü de dahil olmak üzere Organotipik retina wholemount kültür gibi in vivo (1) kurulmasına adım gösteri bir adım Eksojen olarak uygulanan rekombinant faktörleri varlığında kültür sonra apoptoz ve Organotipik wholemounts retinal hücre çoğalması, örn.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture at JoVE.com

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Bu video makale Organotipik retina wholemount kültürler ve eksojen kaynaklı etkileri analizi için bir sitospin prosedürü kurulması göstermektedir. Organotipik retina wholemount kültürleri taklit<em&gt; In vivo</em&gt; Durum ve klasik fare hayvan modellerinde dezavantajları engellemeyi deneysel manipülasyonlar için fare retina erişilebilirliğini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.

Organotipik murin Retina Wholemount Kültür in vivo

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K Görüntüleme.  University of Duisburg-Essen. Bu video makale Organotipik retina wholemount kültürler ve eksojen kaynaklı etkileri analizi için bir sitospin prosedürü kurulması göstermektedir. Organotipik retina wholemount kültürleri taklit In vivo Durum ve klasik fare hayvan modellerinde dezavantajları engellemeyi deneysel manipülasyonlar için fare retina erişilebilirliğini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.

Video: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Yetişkin Tavşan Retina Organotipik Kültürü

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Biyoloji

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...