Protokol, StreptococcuS'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin yetiştirilmesi için kolay bir yöntem sunuyor. mutans ve Candida albicans. Daha sonraki konfokal mikroskopi tabanlı pH ratiometrisi, bu biyofilmlerin hücre dışı matriks içindeki pH gelişimlerinin doğru izlenmesini sağlar.
Görüntü edinme parametrelerinin dikkatli seçimi, sonraki analizler için yeterli kontrasta sahip görüntü verilerini elde etmek için son derece önemlidir. pH ratiometris gerçek zamanlı olarak çapraz krallık biyofilmlerde hem yatay hem de dikey pH gradyanları çalışma için hızlı, hassas ve ucuz bir yöntemdir. pH oranlı metritrisi tamamen mantar ve bakteriyel biyofilmlerde de yapılabilir.
Bu yöntem biyofilmlerde mikrobiyal metabolizma anlayışımızı artırmaya katkıda bulunur. Biyofilm büyüme prosedürünü gösteren Anette Aakjaer Thomsen, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Aerobik koşullarda 37 santigrat derecede kan agar plakaları üzerinde S.mutans ve C.albicans grow.
Sonra her organizmanın tek kolonilerini beş mililitre beyin kalp infüzyonu yla dolu tüpleri test etmek için aktarın ve bunları 18 saat daha büyütün. Ertesi gün, beş dakika için 1, 200 kez g kültürleri santrifüj ve supernatant atın. Fizyolojik salin deki hücreleri yeniden askıya alın ve Hem C.albicans hem de S.mutanlar için OD 550'yi 0.5'e ayarlayın.
Sonra eşdeğer konsantrasyonları elde etmek için S.mutans süspansiyon 1 ila 10 seyreltmek. Pipet 50 mikrolitre steril tükürük çözeltisi mikroskopisi için optik bir alt 96 kuyuluk kuyularına. Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın, sonra tabağı 100 mikrolitre steril fizyolojik salin le üç kez yıkayın ve kuyuları boşaltın.
Her kuyuya 100 mikrolitre C.albican süspansiyonu ekleyin, tabağı 37 derecede 90 dakika kuluçkaya yatırın, sonra kuyuyu tuzlu suyla üç kez yıkayın. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre ısı yalıtımlı fetal sığır serumu ekleyin. Tabağı iki saat kuluçkaya yatırın, sonra tuzlu suyla üç kez yıkayın.
Kuyuları boşaltın, ancak aşırı kesme kuvvetini önlemek için 20 mikrolitrelik bir rezervuar bırakın. Her kuyuya %5 sakaroz ile 100 mikrolitre S.mutan syanımı ve 150 mikrolitre BHI ekleyin. Daha sonra 24 saat veya daha uzun süre 37 santigrat derece plaka kuluçka.
Eski biyofilmleri yetiştirirken, günlük ortamı değiştirin. Krallıklar arası büyüme evresinin sonunda, tabağı steril fizyolojik salinle beş kez yıkayın. Oranmetrik pH görüntüleme için 63X yağ veya su daldırma lensi, 543 nanometre lazer hattı ve spektral görüntüleme sistemi ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.
Mikroskop aşamasını 35 santigrat dereceye ısıtmak için bir kuluçka makinesi kullanın. Yeşil floresan'ın 576'dan 608 nanometreye ve kırmızı floresan629'dan 661 nanometreye eş zamanlı olarak algılanması için dedektörü ayarlayın. Sonra uygun bir lazer gücü seçin ve üzerinde ve az pozlama önlemek için kazanç.
İğne deliği boyutunu bir hava ünitesine veya yaklaşık 0,8 mikrometrelik optik dilime ayarlayın. Ardından görüntü boyutunu 512'ye 512 piksel, tbmm hızını ise ikiye ayarlayın. Ortalama seçeneğini kullanarak iki satır ortalaması seçin.
100 mikrolitre steril fizyolojik salin hazırlayın ve %0.4 glikoz pH 7'ye titre edin. Sonra C-SNARF-4 bir stok çözüm yapmak ve 30 mikromolar son konsantrasyona boya ekleyin. 20 mikrolitrelik rezervuar bırakarak çapraz krallık biyofilm ile kuyulardan birini boşaltın ve glikoz ve oranmetrik boya ile tuz ekleyin.
Plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve görüntülemeye başlayın. 35 santigrat derecede 0,2 pH birim lik artışlarla pH 4 ila 7,8'e ayarlanmış 50 milimolar MES arabelleği hazırlayın. Pipet 150 mikrolitre her tampon çözeltisi optik alt 96-iyi plaka kuyularına.
30 mikromolar konsantrasyonunda tampon dolu kuyulara boya ekleyin ve beş dakika boyunca dengesağlar. Mikroskop aşamasını 35 dereceye ısıtın ve daha önce açıklanan oranmetrik pH görüntüleme ile aynı ayarları seçin. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve kuyuların dibine odaklanın.
Tüm arabellek çözümleri için yeşil ve kırmızı kanal görüntüleri edinin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak. Kalibrasyon denemesini üç eritme de gerçekleştirin ve tüm görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
Yeşil ve kırmızı görüntüleri ayrı klasörlerde saklayın ve her iki dosya serisini de sıralı sayılarla yeniden adlandırın. Görüntüleri ImageJ gibi özel görüntü çözümleme yazılımına aktarın. Lazer kapalı çekilen görüntülerde, ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için analiz ve histogram tıklayın.
İşlem, matematik ve çıkarma işlemini tıklatarak bu değeri biyofilm görüntülerinden çıkarın. Daha sonra iki resim serisini daime'ye aktarın ve segment, otomatik segmentasyon ve özel eşiği tıklatarak kırmızı kanal görüntülerinin eşiğe dayalı bölümlemesini gerçekleştirin. Mantar sitoplazmasının floresan yoğunluğunun üzerindeki düşük eşiği ve mantar hücre duvarlarının ve bakterilerin yoğunluğunun altındaki yüksek eşiği ayarlayın.
Daha sonra segmente tıklayarak ve nesne katmanı aktararak parçalı görüntü serisinin nesne katmanını yeşil kanal görüntü serisine aktarın. Kırmızı ve yeşil kanal serisindeki nesne olmayan pikselleri silin. Şimdi biyofilm görüntüleri bakteri ve mantar hücrelerinden temizlenir ve TIFF dosyaları olarak ihraç edilebilir.
Görüntü serisini ImageJ'e geri aktarın ve kırmızı resim serisini tek başına bölün. Ardından sonucu özgün görüntü serisiyle çarpın. Ortaya çıkan görüntü serisi, sıfır yoğunluktaki tüm pikseller kaldırılsa da orijinalle aynıdır.
Yeşil görüntü serisi ile işlemi tekrarlayın. Ardından, dedektör gürültüsünü telafi etmek için her iki görüntü serisindeki ortalama filtreyi kullanın. Yeşili kırmızı görüntü serisine bölün ve bu da tüm nesne pikselleri için yeşil-kırmızı oranını verir.
Sağlam krallıklar arası biyofilmler 24 ve 48 saat sonra kuyu plakalarında geliştirildi. Mantar hyphae ve büyük hücre içi boşluklar etrafında gruplanmış tek hücre ve S.mutan zincirleri hacimli bir matrisin varlığını göstermiştir. Hücre dışı alandaki pH bir arama tablosu kullanılarak görüntülendi.
Biyofilmlerdeki hücre dışı pH glikoza maruz kaldıktan sonraki ilk beş dakika içinde hızlı bir şekilde düştü. Bundan sonra, asitleşme genellikle 15 dakika sonra 5,5-5,8 değerleriulaşan yavaşladı. Yerel pH değişimleri nedeniyle biyofilmlerdefloresan yoğunluğu zaman içinde değişmiştir.
Görüntü segmentasyonu sırasında, bakteri ve mantar hücrelerinin kapsadığı tüm alanları yeterince ortadan kaldırmak için yüksek ve düşük eşikler seçilmiştir. Mavi ve yeşil alanlar sırasıyla düşük ve yüksek eşikler tarafından elendi. Görüntü edinme parametrelerinin dikkatli seçimi bakteri hücreleri, mantar hücreleri ve biyofilm matrisi arasında iyi bir kontrast elde etmek için çok önemlidir.
Akış hücrelerinde krallıklar arası biyofilmler yetiştirilirse, pH gelişmeleri ağız boşluğundakileri taklit eden akış koşulları altında izlenebilir. pH oranları, özellikle düşük pH'lı dental biyofilmlerde ki yerel alanları belirlemek için kullanılmıştır.
