The authors are financially supported by the Swiss National Science Foundation through an operating grant N&#176; 31003A-149566 (to N.D.), and The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust through a Young Investigator Subsidy (to P.N.).

Etik Beyanı: Tüm hayvan manipülasyonları Cenevre Üniversitesi Hayvancılık Araştırma Komitesi kurallarına sıkı göre yapıldı. Fagositik Hedeflerinin 1. Hazırlık <ol><li> 10 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) kurutularak zimosan 20 mg ekleyin. 10 dakika boyunca kaynar su banyosuna Vorteks ve ısı. 5 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de Serin ve santrifüj. </li><li> Bir su banyo sonikatörü içinde 10 dakika için supernatant, 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon ve sonikasyon çıkarın. Iki adet 1,5 ml&#39;lik tüplere 500 ul aktarın. 5 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 500 ul PBS ile yıkama tekrarlayın. Kaynatıldı zimosan donduruldu ve -20 ° C&#39;de saklanır, bölünmüş olabilir. </li><li> Taze CO 3 0,1 M Na-2 hazırlanan 500 ul, pH 9,3, yukarıdaki (aşama 1,2) iki kez zimosan yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra 490 ul süspanse. 10 mg 10 ul ekle / FITC dimetil sulfoxid içinde eritildi mle (DMSO), girdap, folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında 4 saat boyunca çalkalanarak kuluçkalayın. </li><li> Önce 0.5 mi DMSO + 300 ul PBS, daha sonra 0.5 ml DMSO + 450 ul PBS, o zaman sadece PBS sonra + 150 ul PBS, 0.5 ml DMSO, yukarıda tanımlandığı gibi (aşama 1,2) yıkama, bağlanmamış boya kaldırın. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak zymosan güvenin. 500 ul PBS, girdabına zimosan 1 ul ekleyin, o zaman merkezi ızgara üzerine yerleştirilen lamel karşılayan hemositometre odasına kenarına 10 ul ekleyin. 20X amacı ile donatılmış bir aydınlık alan mikroskop hemositometre monte edin. </li><li> 16 kareler içeren sol üst köşesindeki odaklanın ve bir el taksitli sayacı kullanarak bu alandaki tüm zimosan parçacıkları saymak. Sağ alt köşede tekrarlayın. = Zymosan konsantrasyon / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml Sayısı: aşağıdaki denklem kullanılarak zymosan konsantrasyonunu hesaplayın. Etiketli zimosan donduruldu ve -20 ° C&#39;de saklanır, bölünmüş olabilir. </li><li> Etiketli zymosan wi opsonize100 seyreltme: 1 bir tavşan anti-zimosan antikor th. Vorteks ve 37 ° C su banyosu içinde 1 saat boyunca inkübe edilir. (Adım 1.2) yukarıdaki gibi 500 ul PBS ile yıkayın. Not: zymosan sonra analiz daha zorlaştırabilir öbekler şeklinde eğilimi Sonikasyon yüksek, özellikle de opsonızasyonu sonra, tavsiye edilir. % 65 h / h sıçan ya da insan serumu ile Opsonizasyon alternatif olarak kullanılabilir. </li><li> Adımda 1,7-1,8 de tarif edildiği gibi, bir hemositometre kullanılarak zimosan Sayısı ve 100 x 10 6 parçacık / mL&#39;ye seyreltilir. Örneğin tamamlayıcı veya opsonızasyonu gibi diğer fagositik uyarıcıları ile Opsonizasyon alternatif gerçekleştirilebilir. </li></ol> 2. Canlı Video Mikroskopi <ol><li> Başka bir yerde 38 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi primer fare nötrofil izole edin. <ol><li> Alternatif olarak, herhangi fagositik hücre türünü kullanın. Roswell Park Memorial Institute (RPMI),% 5 fetal dana serumu (hacim / hacim), 200 U penisilin / streptomyci ile desteklenmiş 1640 ortam içinde buz üzerinde tutun nötrofillerin, 10 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda kullanıma hazır olana kadar. Diğer hücre tipleri 1-4 gün önce, tohumlanabilir. </li></ol></li><li> , 35 mm cam alt çanağın merkezine nötrofillerin 2 x 10: 5 (20 ul) ilave edilir ortam 50 ul ekleyerek damla yayılması ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 mi belirli bir MPO inhibitörü 4-aminobenzoik hidrazid (4-ABH, 10 uM) ihtiva eden 37 ° C&#39;ye ısıtıldı ekleyin. Sodyum azit (5 mM) gibi Spesifik olmayan MPO inhibitörleri de kullanılabilir, ancak yakın zamanda, pH 39 ek spesifik olmayan etkiler gösterir uygulamak için önerilmiştir. </li><li> Bir 37 ° C ısıtma sistemi ve 40X petrol amacı ile donatılmış bir geniş açılı floresan mikroskop çanak monte edin. Hücreler ve ekipmanlar denge sağlamak için 10 dakika için görüntüleme hücrelere inkübe edin. </li><li> Parlak-alan iletim görüntü elde etmek için mikroskop ayarlarını yapın [phase ya da 440 nm ya da 490 nm eksitasyon ve 535 nm emisyonda, her 30 saniyede eğer varsa diferansiyel girişim kontrast (DIC)]. </li><li> Çok fazla photobleaching ve fototoksisite ve deneysel sorular bağlı olarak soruluyor önlemek için mikroskop sistemine göre pozlama süresini ve satın alma sıklığını ayarlayın. Görüntü elde etme başlayın. </li><li> 2 dakika sonra, 10 x 10 6 (50 ul), FITC-zimosan çanak merkezine opsonize ekleyin. Kullanılan fagosit ve hedefin tipine bağlı olarak hücre oranlarını: Hedef ayarlayın. </li><li> 30 dakika boyunca görüntülemeyi devam edin. 30 dakika sonra time-lapse edinimi durdurmak ve bir zamanlayıcı başlar. Sahne taşıyın ve 5 dakika içinde, görüntü diğer fagozomların bakış farklı alanlarda 10 veya daha fazla anlık yakalamak. </li></ol> 3. Kalibrasyon ve Kontrol Deneyleri <ol><li> Deney günü (tarifleri Tablo 1&#39;de tarif edilmektedir), önceki pH ayarlama solüsyonlarının hazırlanması ve 10 ml&#39;lik miktarlar halinde dondurma.Bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;kalibrasyon çözümleri ve sıcak çözülme. Bir pH ölçer ile pH kontrol ve çözeltiler gerçek pH kaydedilir. </li><li> Önceki görüntü alımı için cam alt çanak peristaltik bir pompa monte edin ve (bölüm 2) Yukarıda açıklandığı gibi canlı video mikroskopi gerçekleştirin. </li><li> 30 dakika iktisap sürenin sonunda, yemeğin içindeki çözüm kaldırmak için pompa açın ilk kalibrasyon çözeltisinin 1 ml ekleyin ve pompayı durdurun. </li><li> Sinyal genellikle 5 dakika stabilize kadar bekleyin. Her kalibrasyon çözeltisi ile tekrarlayın. <ol><li> Deney, günde en azından bir kalibrasyon gerçekleştirin ve yüksek pH ile başlayan ve en sıralı olarak çalışma, hem de düşük pH başlayarak ve en yüksek doğru ardışık çalışma kalibre edin. </li></ol></li><li> Bir kontrol olarak, cam alt tabak içinde 900 ul HBSS içinde hücreler, HBSS içinde seyreltilmiş 100 uM NADPH oksidaz inhibitörü difenil propionium iyodür 100 ul (DPI) ekleyin ve10 dakika inkübe edilir. </li><li> Edinimi başlatın ve (adım 2.7) yukarıdaki gibi zymosan ekleyin. Fagositoz 15 dakika sonra HBSS içinde seyreltilmiş bir (conca) konkanamisin 10 uM V-ATPaz inhibitörü 10 ul ve 15 dakika daha devam görüntüleme. </li></ol> 4. Analiz <ol><li> Time-lapse film ve fagosom anlık analizi. Not: Aşağıdaki talimatlar ImageJ için özeldir. Adım adım talimatlar kullanılan yazılım bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir, ancak bu bölümde anlatılan fonksiyonlar en profesyonel görüntü analiz yazılımı mevcuttur. <ol><li> Profesyonel görüntü analiz yazılımı ile görüntüleri açın. Hiçbir hücreler vardır bir alanda kare çokgen seçim aracıyla küçük bir kare yatırım getirisi çizim ve ROI Eklentiler&gt; BG Çıkarma tıklayarak 490 kanal arka plan çıkarın. Ardından&gt; tıklayarak Düzen&gt; Seçim 440 kanalda aynı yatırım getirisini yüklemek Seçme ve tekrarı geri yükleyin. </li><li>Daha sonra Operasyonu açılır menüden &#39;Divide&#39; seçerek, ... Süreç&gt; Görüntü Hesaplama tıklayarak Image1 ve image2 açılır menülerden uygun görüntüleri seçerek 440 kanala bölünür 490 kanal 32-bit oranı görüntü olun ve 32-bit (float) sonuç check-kutusunu işaretleyerek. </li><li> &gt; Rainbow RGB Görüntü&gt; Arama Tabloları tıklayarak bir oran ile uyumlu renk kodlama renk kodlama look-up tablosu değiştirin. Eşik oranı görüntü&gt; Threshold&gt; Görüntü tıklayarak 0 ve sonsuzluk piksel ortadan Ayarlanır .... NaN onay kutusunu Set arka plan piksel seçili olduğundan emin hale o zymosan kırmızı görünür, böylece kaydırma çubuklarını ayarlayın ve Uygula&#39;yı tıklatın. </li><li> Görüntü tıklayarak bir çok kanallı kompozit içine parlak alan kanalı ile bu oran yığını birleştirin&gt; Renk&gt; Kanallar Birleştirme ve gri kanal açılır menüden parlak alan görüntü ve yeşil kanal açılır menüden oran görüntüsünü seçme ve seçmeOnay kutusunu kaynak görüntüleri tutun. Time-lapse film veya fagozomların analiz edilmelidir belirlemek için anlık tarayın. Parlak alan kanal için yararlıdır. </li><li> Ekle&gt; fagozomların etrafında oval poligon seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgelerini çiziniz ve Analiz&gt; Araçlar&gt; ROI Yöneticisi tıklayarak ROI yöneticisi ekleyebilirsiniz. Daha fazla&gt; Çok ölçün ve dilim onay kutusunun başına bir satır de-seçilerek tıklayarak kendi zymosan yoğunluk oranını ölçün. </li><li> Time-lapse film için, parça her zaman noktasını ölçmek için Ctrl + M yazarak, bir yatırım getirisi çizim ve zamanla yoğunluk değerlerini izlemek için gerektiğinde yatırım getirisi hareket ettirerek bir seferde bir fagozomların. Bir elektronik tablo yazılımı içine Sonuçları penceresinde ölçümleri kopyalayın. Not: bağımsız deneyler 15 (deney x 3 başına 5 zamanlı kurslar) Analizi ideal ama daha az ya da gözlenen değişkenlik bağlı gerekebilir olduğunu. İB&#39;leri Tasarruf her zaman tavsiye edilir. Bazı yazılım paketleri izin görüntü regiStration ve İB&#39;nin dinamik güncelleştirme, analiz bu bölümünü kolaylaştırmak. </li></ol></li><li> Floresans pH değerlerine Dönüşüm <ol><li> Bölüm 4.1&#39;de açıklandığı gibi kalibrasyon time-lapse filmlerde fagozomların için 490/440 oranını ölçün. </li><li> Elektronik tabloda zamanla oran değerlerini çizmek ve her pH kalibrasyonu karşılık gelen süre ortasında içinde 5 zaman noktalardan (5-20 arası, genellikle) görüş alanı içindeki tüm fagozomların ortalama oran değerlerini hesaplamak Çözelti. (Ayrıca Şekil 5A kırmızı kutuları bakın.) </li><li> Gerçek ölçülen pH karşı bu ortalama 490/440 oranı değerlerini çizilir. Tek bir grafiğe içine en az 3 bağımsız kalibrasyon birleştirin. Genellikle sigmoid denkleme, doğrusal olmayan regresyon (en iyi uyum eğrisi) gerçekleştirmek için bir istatistik veya sayısal bir yazılım paketi kullanın. Not: Örneğin, Şekil 5B&#39;de kullanılan denklem Boltzmann sigmoidal oldu [Y = Taban + ((Top-Taban)/ (1 + EXP ((V50-X) / Eğim)) Y değerleri 490/440 oranları], X pH değerleri ve Üst, Alt, V50 ve eğim parametreleri yazılım tarafından hesaplanır vardır. </li><li> PH oranı değerleri dönüştürmek için elde edilen denklemi kullanın. Not: Örneğin, Şekil 5B&#39;de, sodyum azid mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisi için elde edilen denklem şöyledir 490/440 oranı = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . pH Çözme aşağıdaki denklemi sağlar: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1,178 / (Oran-1,103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yeung, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+signaling+and+the+modulation+of+surface+charge+during+phagocytosis.">Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis.</a> Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Fairn, G. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+nascent+phagosomes+mature+to+become+phagolysosomes.">How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes.</a> Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).</li><li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+NADPH+oxidase+and+associated+ion+fluxes+during+phagocytosis.">Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis.</a> Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).</li><li>Binder, B., Holzhutter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothetical+model+of+cargo-selective+rab+recruitment+during+organelle+maturation.">A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation.</a> Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).</li><li>Hurtado-Lorenzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V-ATPase+interacts+with+ARNO+and+Arf6+in+early+endosomes+and+regulates+the+protein+degradative+pathway.">V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway.</a> Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).</li><li>Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidification+and+protein+traffic.">Acidification and protein traffic.</a> Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).</li><li>Huynh, K. K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vacuolar+pH+and+its+modulation+by+some+microbial+species.">Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).</li><li>De Vito, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sodium/hydrogen+exchanger:+a+possible+mediator+of+immunity.">The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity.</a> Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).</li><li>Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion+channels,+including+ClC-3,+are+required+for+normal+neutrophil+oxidative+function,+phagocytosis,+and+transendothelial+migration.">Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).</li><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+reactions+and+microbial+killing+in+the+neutrophil+phagosome.">Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).</li><li>Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-Gated+Proton+Channels+as+Novel+Drug+Targets:+From+NADPH+Oxidase+Regulation+to+Sperm+Biology.">Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology.</a> Antioxid Redox Signal. , (2014).</li><li>Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+production+in+the+phagosome:+impact+on+antigen+presentation+in+dendritic+cells.">Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).</li><li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-+and+macrophage-targeted+NADPH+oxidase+mediates+antifungal+host+defense+and+regulation+of+acute+inflammation+in+mice.">Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice.</a> J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium.">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).</li><li>Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+proton-selective+channel+lacking+the+pore+domain.">A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain.</a> Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).</li><li>El Chemaly, A., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+Hv1+proton+channels+regulate+the+ionic+and+redox+homeostasis+of+phagosomes?.">Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes?.</a> Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).</li><li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases.">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leukoc Biol. , (2014).</li><li>Decoursey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+proton+channels.">Voltage-gated proton channels.</a> Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).</li><li>Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hv1+proton+channels+are+required+for+high-level+NADPH+oxidase-dependent+superoxide+production+during+the+phagocyte+respiratory+burst.">Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+acidification+in+Mycobacterium+phagosomes+produced+by+exclusion+of+the+vesicular+proton-ATPase.">Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase.</a> Science. 263 (5147), 678-681 (1994).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+and+avirulent+strains+of+Francisella+tularensis+prevent+acidification+and+maturation+of+their+phagosomes+and+escape+into+the+cytoplasm+in+human+macrophages.">Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages.</a> Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).</li><li>Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+activates+virulence+gene+transcription+within+acidified+macrophage+phagosomes.">Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).</li><li>Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+macrophages.+In+situ+assessment+of+vacuolar+H(+)-ATPase+activity,+counterion+conductance,+and+H++'leak'.">Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).</li><li>Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+candidacidal+activity+in+macrophages+activated+by+recombinant+gamma+interferon.">Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon.</a> Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).</li><li>Ip, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+phagosome+acidification+are+required+for+pathogen+processing+and+MyD88-dependent+responses+to+Staphylococcus+aureus.">Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).</li><li>Clarke, M., Maddera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocyte+meets+prey:+uptake,+internalization,+and+killing+of+bacteria+by+Dictyostelium+amoebae.">Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae.</a> Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).</li><li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils.">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li><li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH.">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li><li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells.">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126 (1), 205-218 (2006).</li><li>Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner.">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li><li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+(GILT)+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages.">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li><li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+(AIM)+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy.">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).</li><li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy.">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li><li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents.">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li><li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSOP/Hv1+proton+channels+sustain+calcium+entry,+neutrophil+migration,+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification.">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li><li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH.">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock:+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems.">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li><li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel.">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li><li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks.">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li><li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations.">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Daha fazla zaman hedefleri bağlanmış bir pH duyarlı boya kullanılarak benzer bir strateji geliştirerek, ancak fagozomların bir popülasyonunun ortalama pH ölçer gibi spektroskopi ve FACS gibi alternatif yöntemler, daha zaman alıcı olmakla birlikte, mikroskopi çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, iç ve dış içsel bağlı değil, diğer bir deyişle, partiküllerin kolayca sırasıyla gidermek ya da dış parçacıklar etiket, örneğin tripan mavisi ya da antikorlar gibi diğer kimyasallar eklem...

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O2- and its derivative reactive oxygen species (ROS) 2,4. 
The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes 5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na+/H+ exchanger or ClC family Cl-/H+ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H+ translocation 9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils 4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba 13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H+ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H+ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme 17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH 22-24.
In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing 25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism 28. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)11, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later 29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH 31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions 33. 
Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH 34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies 36, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses. 
Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH 19. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm 37. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymosan A powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z2850</td>
			<td>Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-204107</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenyleneiodonium chloride (DPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2926</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanamycin A (ConcA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27689</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monensin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-026-G001</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balance salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Ringer&#39;s balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Ibidi &#181;-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath</td>
			<td>O. Kleiner AG</td>
			<td></td>
			<td>A sonicator may be used instead, various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamocytometer</td>
			<td>Marienfeld GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield live imaging microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Dynamax RP-1)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Schott Gerate GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Counter</td>
			<td>Milian SA</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagosome ph by ratiometric fluorescence microscopy

Fagositoz doğuştan gelen bağışıklık hücreleri öldürmek veya etkisiz yutulur malzeme veya antijen olarak sunmak ve adaptif immün yanıtları başlatmak için bakteri, apoptotik hücreler veya diğer yabancı partikülleri yutmak hangi aracılığıyla temel süreçtir. Fagozomların pH endomembranes ve proteolitik enzimler, fagositik vakuol bir parçalayıcı organele içine olgun izin olaylar aktivasyonu ile fizyon ya da füzyon düzenleyen kritik bir parametredir. Buna ek olarak, H + translokasyon diğer konakçı dokulara etkili bir öldürme için önemli ve sinyal olan reaktif oksijen türlerinin (ROS), yüksek seviyelerinin üretimi için gereklidir. Birçok hücre içi patojenler, phagosomal asitlenmesine sınırlayıcı fagosom biyoloji pH önemini vurgulayarak fagositik öldürmeyi yıkmak. Burada floresein izotiosiyanat (FITC) kullanılarak nötrofillerde phagosomal pH ölçmek için bir yöntem tarif rasyometrik fagositik targ olarak zimosan -etiketliets ve canlı hücre görüntüleme. Deney 490 nm&#39;de uyarıldığında, ancak tek bir boyanın, yerine mutlak floresandan daha, bir pH bağımlı oranının sayılmasına olanak tanıyan, 440 nm&#39;de uyarıldı olmadığında asidik pH ile söndürülür FITC, floresan özelliklerine dayanır. In situ boya kalibrasyonu ve gerçek pH değerlerine oranı dönüştürme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol, aynı zamanda temin edilmektedir. Onlar böyle ağartma olarak tedirginlikler daha az duyarlı olarak tek boya rasyometrik yöntemleri genellikle tek dalga boyu veya çift boya sözde rasyometrik protokollere üstün kabul edilir, ölçülen sinyali tahrif değişiklikleri, lazer varyasyonları ve düzensiz etiketleme, odak. Bu yöntem, kolaylıkla diğer fagositik hücre tiplerinde pH ölçmek için modifiye edilebilir ve zymosan atıl tanelerden canlı mikroorganizmalara, diğer herhangi bir amin içeren bir parçacık ile ikame edilmiş olabilir. Son olarak, bu yöntem, farklı pH aralıklarında ya da diğer phagosom karşı duyarlı olan diğer floresan probları faydalanmak için adapte edilebiliral faaliyetleri, bu fagozomların fonksiyonel görüntüleme için genel bir protokol yaparak.

Aşağıda bir deney için temsili sonuçlar olduğu takdirde burada yabani tip ya da kemik-iliğinden izole edilmiş primer fare nötrofil phagosomal pH Hvcn1 - / - farenin karşılaştırıldı. Başarılı bir deneme için, daha sonra görüntü analizi sırasında segmente daha zor olacaktır çok fagozomların, kaçınarak, time-lapse film tüm süresince görüş alanı içinde yeterli fagozomların elde etmek önemlidir. Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi İyi ve k...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K Görüntüleme.  University of Geneva. Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy. 