Yani INSAN genomundaki DNA metilasyonunun karmaşık sapması için LA platformu ile DNA metilasyon genomu çapında analiz gastrointestinal kanserde epigenetik biyobelirteçler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Dna metilasyonunun insan genomundaki karmaşık sapmaları için bu LA platformu olsa da, maliyet ve genomik kapsama açısından en uygun uyguluyor. Prosedürü gösteren hirotaka Momose, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak.
Başlamak için, lekesiz formalin-sabit parafin gömülü bölümleri 10 mikrometre hazırlayın. Slaytları cam bir kaydırak tutucuya yerleştirin ve slayttaki tüm dokunun batırdığından emin olmak için tuzlu suyla doldurun. Slaytları 15 dakika ksilenin içinde bırakın, sonra düşmemek için slaytları pipet ucuyla tutarken ksilenini dökün.
Daha önce olduğu gibi aynı seviyeye daha fazla ksilene dökün ve kuluçka tekrarlayın. Ksilenin dökün ve slayt tutucusunu %100 etanolle doldurun, slayttaki tüm dokunun tamamen batırDığından emin olun. Üç dakika boyunca etanol slaytlar bırakın, sonra taze etanol ile etanol değiştirin ve onları iki dakika daha kuluçkaya izin.
Etanol dökün ve slaytlar kaldırın. Dikkatle temiz bir kağıt havlu üzerinde yüz yerleştirin ve onları 10 dakika kurumasını bekleyin. 1,5 mililitrelik tek kullanımlık polipropilen tüpü 80 mikrolitre likte tamponla doldurun ve tampona temiz bir pipet ucu koyun.
Uygun H&E lekeli kesitine göre tümör bölgesinin en uygun kanser dokularını belirleyin, ardından işaretli bölüme göre kanser dokusunu makrodissect. Temiz bir jilet alın ve yavaşça tek parça halinde tutmaya çalışırken slayt kapalı kanser dokusu kazıyın. Kazınmış dokuyu lysis tampon şişesine aktarmak için pipet ucunu kullanın.
Bu işlemi slaytların geri kalanıyla birlikte tekrarlayın. Tüm doku tüp içinde sonra, doku tamamen batık olduğundan emin olmak için ucu kullanın ve duvara sıkışmış değildir. Şişeye 20 mikrolitre subtilisin ile ilgili serin proteaz ekleyin ve hafifçe karıştırın.
Şişeyi en az dört saat veya bir gece boyunca 55 derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin ve iki saat sonra hafifçe girdap olacağından emin olun. Üreticinin talimatlarına göre bisülfit dönüşüm kiti kullanarak sindirilmiş dokunun 45 mikrolitre üzerinde bisülfit tedavisi gerçekleştirin. Numuneye beş mikrolitre seyreltme tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Bu arada, CT dönüşüm reaktifbir tüp 750 mikrolitre distile su ve seyreltme tampon 210 mikrolitre ekleyerek bisülfit dönüşüm reaktifi hazırlayın. Tüpleri 10 dakika girdap yaparak karıştırın, ardından her numuneye 100 mikrolitre hazırlanmış CT dönüşüm reaktifini ekleyin ve ters çevrilerek karıştırın. Numuneleri karanlıkta 50 derecede 12 ila 16 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, örnekleri 10 dakika buzun üzerine yerleştirin. 400 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin ve her numuneyi yukarı ve aşağı boruyla karıştırın. Her numuneyi bir spin sütununa yükleyin ve sütunu iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin.
Numuneleri bir dakika boyunca tam hızda santrifüj edin ve akışı atın. Her sütuna 200 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca tam hızda döndürün, ardından akışı atın. Her sütuna 200 mikrolitre desülfobik tampon ekleyin ve sütunların oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.
Kuluçkadan sonra, bir dakika boyunca tam hızda sütunları döndürün ve akışı atın. Her yıkamadan sonra tam hızda bir dakika boyunca 200 mikrolitre yıkama tamponsanlığı ile kolonu iki kez yıkayın. Her kolona 46 mikrolitre distile su ekleyin ve yeni bir steril 1,5 mililitre tek kullanımlık polipropilen tüp yerleştirin.
DNA'yı elemek ve sütunu atmak için tüpleri iki dakika döndürün. DNA analiz için hazır. Her gen analizinde organizatör bölgesinin metilasyonunu değerlendirmek için kantitatif metilasyona özel PCR için bir şablon olarak bisülfit modifiye edilmiş DNA'yı kullanın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi reaktifleri birleştirin ve termo bisiklet protokolünü çalıştırmak için 96 iyi bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanın. Eğitim kohortundaki 48 mide kanseri hastasının özellikleri burada gösterilmiştir. Hastaların ortanca yaşı 74 idi ve kohortta 38 erkek ve 10 kadın vardı.
İlk olarak, 48 numunenin tümü de aykırı ların tespiti için yüklendi. İki örnek diğerlerinden iki standart sapmadan daha büyük zirveler verdi ve bu örnekler kaldırıldı. Ortaya çıkan ısı haritası yüksek ve düşük metilasyona göre iki gruba ayrılmıştır.
Bu ısı haritası, diferansiyel metilasyon analizinde transkripsiyonel başlangıç alanının 1, 500 baz çifti içinde en iyi 50 probun görselleştirilmesini sağlar. Çok değişkenli analizde klinik patolojik faktörler inkişa etken olarak kullanıldığında kanser tipi ve lenf nodu metastazı varlığı önemli bağımsız prediktif faktörler olarak ortaya çıkmıştır. Son olarak, EPB41L3 geninin mikrodizi analizinde eğitim kohortunu yüksek ve düşük metilasyon gruplarına kodlamakla güçlü bir şekilde ilişkili olduğu bulunmuştur.
Test kohortundaki EPB41L3 mikrodizi analizinin sonuçları nicel metilasyona özgü PCR ile doğrulandı. PGC dokularında EPB41L3 rmvs univariate analizinde kalıntı mide kanseri olanlara göre anlamlı olarak yüksekti. Benzer şekilde, lenf nodu metastazı olan örneklerde rcv'ler lenf nodu metastazı olmayanlara göre anlamlı olarak yüksekti.
Bu nedenle bu protokolübaşarıyla gerçekleştirmek için uygun H&E lekeli kesite göre makrodiszeksiyon için en uygun kanser dokusuüzerinde tanımlama gereklidir.
