Слюнные железы насекомых, необходимы для передачи многих заболеваний человека. Таким образом, лучшее понимание биологии железы заработной платы должно помочь нам, добавить к существующим стратегиям профилактики заболеваний. Этот метод позволит нам быстро спросить, влияют ли мутации в регуляторах-кандидатах на морфологию слюнных желез личинок комаров и потенциально влияют на передачу малярийных паразитов.
Первые несколько раз, когда вы работаете с личинками комаров, их трудно понять, поскольку они быстро двигаются. Чем больше вы тренируетесь, тем лучше вы становитесь. Начинать с процедуры будет Марисоль Лучетти, научный сотрудник моей лаборатории.
Чтобы начать эксперимент, поместите горшечную тарелку на ступень рассекающего микроскопа и перенесите 10 личинок комара L4 на пластину горшка. Затем поместите каплю раствора для рассечения на тарелку горшка отдельно от личинок. Используют щипцы, чтобы поместить одну личинку L4, в рассеченный раствор капли 25% этанола.
Держа в каждой руке число пять щипцов, схватите личинок щипцами чуть ниже головы, доминирующей рукой, и захватите голову личинки недоминирующей рукой, затем осторожно потяните голову с минимальной постоянной силой, чтобы отделить от остальной части тела, в то время как железы остаются прикрепленными к голове. После выброса части тела туши личинки соберите головку или слюнные железы в один миллилитр PBS в трубку микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра и дождитесь, пока слюнные железы опустятся на дно буфера. На следующий день слейте раствор, чтобы закрепить ткани, с одним миллилитром холодного 100%-го ацетона в течение 90 секунд.
После удаления ацетона аккуратно промыть ткани три раза, одним миллилитом PBS. Для иммуноокрашивания добавляют первичное антитело, такое как Rab 11, в соответствующем разведении в 200 микролитрах от общего объема PBS. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки.
Инкубируют первичные антитела в течение ночи при четырех градусах, а затем трижды промывают в одном миллилитре PBS. Затем добавляют вторичное антитело, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, в соответствующем разведении, в 200 микролитрах общего объема. После смешивания содержимого с наконечником пипетки инкубируйте ткани с красителями, такими как Nile red и Hoechst в 200 микролитров PBS, при комнатной температуре в течение 60 минут, с последующей промывкой три раза PBS.
Подготовьте слайд микроскопа, добавив 200 микролитров 100% глицерина с пипеткой и перенеся до 20 окрашенных головок с прикрепленными железами и внутренними структурами на предметный предмет микроскопа с помощью мягкой щетки. Разложите образцы головы, чтобы равномерно распределить их по стеклянной горке. Рассматривая под рассекающим микроскопом, отделите личиночную головку от желез, используя две пары щипцов, осторожно потянув две ткани в противоположных направлениях.
Когда все образцы будут сделаны, аккуратно поместите крышку толщиной 1,5 миллиметра поверх слайда, избегая образования пузырьков воздуха, а затем запечатайте слайд прозрачным лаком для ногтей. Слюнные железы относительно легко рассекаются, начиная с личинок четвертой стадии. Личинки самцов и самок можно различить на поздней личиночной стадии L4 красной полосой вдоль спинной грудной клетки самок.
Морфология антенны также более сложна, у самцов, чем у самок личинок L4, как можно видеть, с белыми стрелками, указывающими на них, женскими усиками на левом изображении и мужскими усиками справа. Слюнные железы, выделенные из личинок ранней стадии L4, окрашенные Hoechst, обнаруживают проксимальные и дистальные доли, разделенные узким сужением. Образовавшийся просвет был исследован в иммуноокрашенной дистальной слюнной железе средней и поздней личинки L4.
Апикальные домены секреторных клеток, окружающие формирующийся просвет, имели интенсивное нильское красное окрашивание, наводящее на мысль о микроворсинках, подобных структурам. Окрашивание Rab 11 наблюдалось близко, к апикальной поверхности. Есть только один шаг со временем, и это 90-секундная инкубация тканей в холодном ацетоне.
Этот протокол был разработан только недавно, но мы ожидаем, что он будет полезен всем, кто работает со слюнной железой комара. Мы полностью рассчитываем использовать его часто.
