الغدد اللعابية للحشرات ، مطلوبة لنقل العديد من الأمراض البشرية. لذا فإن الفهم الأفضل لبيولوجيا غدة الراتب ينبغي أن يساعدنا، ويضيف إلى الاستراتيجيات القائمة للوقاية من الأمراض. ستسمح لنا هذه التقنية ، بالسؤال بسرعة عما إذا كانت الطفرات في المنظمين المرشحين ، تؤثر على مورفولوجيا الغدد اللعابية ليرقات البعوض ، وربما تؤثر على انتقال طفيليات الملاريا.
في المرات القليلة الأولى التي تعمل فيها مع يرقات البعوض ، فهي صعبة الفهم أثناء تحركها بسرعة. كلما تدربت أكثر، كلما كان ذلك أفضل. الشروع في العمل مع هذا الإجراء، سيكون ماريسول لوشيتي، مساعد أبحاث البكالوريوس لمختبري.
لبدء التجربة ، ضع صفيحة قعادة على خشبة مسرح المجهر التشريحي ، ونقل 10 يرقات L4 البعوض على لوحة القعادة. ثم ضع قطرة من محلول التشريح ، على لوحة القعادة منفصلة عن اليرقات. استخدام ملقط لوضع واحد L4 يرقة، في إسقاط حل تشريح 25٪الإيثانول.
من خلال حمل ملقط رقم خمسة في كل يد ، فهم اليرقات مع ملقط أسفل الرأس مباشرة ، مع اليد المهيمنة ، وقبضة رأس اليرقة باليد غير المهيمنة ، ثم سحب الرأس بلطف مع الحد الأدنى من القوة الثابتة ، للانفصال عن بقية الجسم ، في حين أن الغدد لا تزال ملتصقة بالرأس. بعد التخلص من جزء الجسم من جثة اليرقة ، اجمع الرأس أو الغدد اللعابية ، إلى ملليلتر واحد من PBS ، في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر ، وانتظر الغدد اللعابية ، لتغرق إلى أسفل العازلة. في اليوم التالي، استنزاف الحل لتركيز الأنسجة، مع ملليلتر واحد من الأسيتون الباردة 100٪ لمدة 90 ثانية.
بعد إزالة الأسيتون، شطف الأنسجة بلطف ثلاث مرات، مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. لاحتواء المناعة، إضافة الأجسام المضادة الأولية مثل راب 11، في التخفيف المناسب، في 200 ميكرولتر من الحجم الإجمالي لبرنامج تلفزيوني. دوامة محتويات أنبوب بلطف مع طرف ماصة.
احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في أربع درجات، تليها غسل ثلاث مرات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية، اليكسا فلور 488 الماعز المضادة الأرنب، في التخفيف المناسب، في 200 ميكرولتر من الحجم الإجمالي. بعد خلط المحتويات مع طرف ماصة، واحتضان الأنسجة مع الأصباغ، مثل النيل الأحمر، وهويشست في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة، تليها غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
إعداد شريحة المجهر، بإضافة 200 ميكرولتر من 100٪ الجلسرين مع ماصة، ونقل ما يصل إلى 20 رؤساء الملون، مع الغدد المرفقة والهياكل الداخلية، في الشريحة المجهر باستخدام فرشاة ناعمة. نشر عينات الرأس بها، لتوزيعها بالتساوي على طول الشريحة الزجاجية. عرض تحت المجهر تشريح، فصل رأس اليرقات من الغدد، وذلك باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، عن طريق سحب بعناية النسيجين في اتجاهين متعاكسين.
عند الانتهاء من جميع العينات، ضع بلطف زلة غطاء سمكها 1.5 ملليمتر، على رأس الشريحة، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء، ومن ثم ختم الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة. الغدد اللعابية سهلة التشريح نسبيا ، من المرحلة الرابعة من اليرقات. يمكن تمييز يرقات الذكور والإناث ، في مرحلة يرقات L4 المتأخرة بشريط أحمر ، على طول الصدر الظهري للإناث.
مورفولوجيا الهوائيات هي أيضا أكثر تفصيلا ، في الذكور مما كانت عليه في يرقات L4 الإناث كما يمكن رؤيتها ، مع السهام البيضاء مشيرا ، والهوائيات الأنثوية على الصورة اليسرى ، وهوائيات الذكور على اليمين. تكشف الغدد اللعابية المعزولة عن يرقات المرحلة المبكرة من L4 ، الملطخة ب Hoechst ، عن الفصوص القريبة والقاصية ، التي يفصلها انقباض ضيق. تم فحص التجويف المشكل ، في الغدة اللعابية البعيدة الملطخة بالمناعة ، من يرقة L4 من منتصف إلى أواخر.
كانت المجالات apical من الخلايا إفرازية، المحيطة التجويف تشكيل مكثفة تلطيخ النيل الأحمر، مما يوحي microvilli مثل الهياكل. وقد لوحظ تلطيخ راب 11 على مقربة من السطح apical. هناك خطوة واحدة فقط مع الوقت، وهذا هو الحضانة 90 ثانية، من الأنسجة في الأسيتون البارد.
تم تطوير هذا البروتوكول مؤخرا فقط ، لكننا نتوقع أنه سيكون مفيدا ، لأي شخص يعمل على الغدة اللعابية للبعوض. ونحن نتوقع تماما لاستخدامه في كثير من الأحيان.
