As glândulas salivares dos insetos.são necessárias para transmitir muitas doenças humanas. Assim, uma melhor compreensão da biologia salarial deve nos ajudar, adicionar às estratégias existentes para a prevenção de doenças. Esta técnica nos permitirá, perguntar rapidamente se mutações nos reguladores candidatos, afetam a morfologia, das glândulas salivares larvais do mosquito, e potencialmente afetam a transmissão de parasitas maláricos.
As primeiras vezes que você trabalha com as larvas do mosquito, elas são desafiadoras de entender à medida que se movem rapidamente. Quanto mais você pratica, melhor você fica. Começando com o procedimento, será Marisol Luchetti, assistente de pesquisa de graduação do meu laboratório.
Para iniciar o experimento, coloque uma placa de penico no palco de um microscópio dissecando, e transfira 10 larvas de mosquito L4 para a placa de penico. Em seguida, coloque uma gota da solução de dissecção, na placa do penico separada das larvas. Use fórceps para colocar uma larva L4 na solução de dissecção de 25% de etanol.
Segurando um número cinco fórceps em cada mão, segure as larvas com fórceps logo abaixo da cabeça, com a mão dominante, e segure a cabeça da larva com a mão não dominante, em seguida, puxe suavemente a cabeça com força constante mínima, para se desprender do resto do corpo, enquanto as glândulas permanecem presas à cabeça. Depois de descartar a porção corporal da carcaça da larva, colete a cabeça ou glândulas salivares, em um mililitro de PBS, em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro, e espere que as glândulas salivares afundem até o fundo do tampão. No dia seguinte, drene a solução para fixar os tecidos, com um mililitro de frio 100% acetona por 90 segundos.
Depois de remover a acetona, enxágue suavemente os tecidos três vezes, com um mililitro de PBS. Para imunostaining, adicione um anticorpo primário como rab 11, na diluição apropriada, em 200 microliters do volume total de PBS. Gire o conteúdo do tubo suavemente com uma ponta de pipeta.
Incubar os anticorpos primários durante a noite em quatro graus, seguido de lavagem três vezes em um mililitro de PBS. Em seguida, adicione o anticorpo secundário, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, na diluição apropriada, em 200 microliters de volume total. Depois de misturar o conteúdo com uma ponta de pipeta, incubar os tecidos com corantes, como o vermelho nilo, e Hoechst em 200 microliters de PBS, em temperatura ambiente por 60 minutos, seguido de lavagem três vezes com PBS.
Prepare um slide de microscópio, adicionando 200 microlitros de 100% glicerol com uma pipeta, e transferindo até 20 cabeças manchadas, com as glândulas anexadas e estruturas internas, por deslizamento de microscópio usando uma escova macia. Espalhe as amostras da cabeça para fora, para distribuí-las uniformemente ao longo do escorregador de vidro. Visualizando sob um microscópio dissecando, separe a cabeça larval das glândulas, usando dois pares de fórceps, puxando cuidadosamente os dois tecidos em direções opostas.
Quando todas as amostras estiverem prontas, coloque delicadamente um deslizamento de cobertura de 1,5 milímetros de espessura, em cima do slide, evitando a formação de bolhas de ar e, em seguida, sele o slide com esmalte claro. As glândulas salivares são relativamente fáceis de dissecar, a partir do estágio quatro larvas. Larvas masculinas e femininas podem ser distinguidas, no estágio larval L4 tardio por uma listra vermelha, ao longo do tórax dorsal das fêmeas.
A morfologia antenal também é mais elaborada, em machos do que em larvas L4 femininas como pode ser visto, com as setas brancas apontando, as antenas femininas na imagem esquerda, e as antenas masculinas à direita. As glândulas salivares isoladas das larvas do estágio L4 inicial, manchadas com Hoechst revelam os lobos proximal e distal, separados por uma estreita constrição. O lúmen formador foi examinado, na glândula salivar distal imuno manchada, de uma larva L4 média e tardia.
Os domínios apical das células secretas, ao redor do lúmen formador, tinham intensa coloração vermelha do Nilo, sugestivas de microvilli como estruturas. A mancha rab 11 foi observada perto da superfície apical. Há apenas um passo com o tempo, e essa é a incubação de 90 segundos,.dos tecidos em acetona fria.
Este protocolo foi desenvolvido recentemente, mas esperamos que seja útil para quem trabalha na glândula salivar do mosquito. Esperamos usá-lo com frequência.
