곤충의 타액선은 많은 인간 질병을 전염시키는 데 필요합니다. 따라서 급여 선생물학에 대한 더 나은 이해가 질병 예방을 위한 기존 전략에 추가하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술은 우리가 후보자 규제 기관의 돌연변이가 모기 애벌레 침샘의 형태에 영향을 미치는지 신속하게 물어 볼 수 있으며 말라리아 기생충의 전송에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다.
모기 애벌레와 함께 일하는 처음 몇 번, 그들은 빠르게 움직일 때 파악하기가 어렵습니다. 연습을 할수록 더 좋습니다. 절차로 시작하는 것은 마리솔 루체티, 내 실험실에 대한 학부 연구 조수가 될 것입니다.
실험을 시작하려면 해부 현미경의 단계에 변기 접시를 놓고 10 개의 모기 L4 애벌레를 변기 판에 옮기. 그런 다음 해부 용액 한 방울을 애벌레와 분리된 변기 판에 놓습니다. 집게를 사용하여 L4 애벌레 1개를 25%에탄올의 해부 용액 방울에 넣습니다.
각 손에 숫자 5 개의 집게를 잡고, 지배적 인 손으로 머리 바로 아래에 집게로 애벌레를 잡고, 비 지배적 인 손으로 애벌레의 머리를 잡고, 부드럽게 최소한의 일정한 힘으로 머리를 당겨, 땀샘은 머리에 부착 남아있는 동안 몸의 나머지 부분에서 분리. 애벌레 시체의 신체 부위를 폐기한 후, 머리 또는 타액 땀샘을 PBS의 1밀리리터로 수집하고, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로, 타액땀샘을 기다린 후 완충제의 바닥으로 가라앉습니다. 다음 날, 90 초 동안 차가운 100 % 아세톤의 1 밀리리터와 조직을 고정하기 위해 솔루션을 배출하십시오.
아세톤을 제거한 후 PBS 의 1 밀리리터로 조직을 세 번 부드럽게 헹구십시오. 면역 염색을 위해, 적절한 희석에서 Rab 11과 같은 1차 항체를 PBS의 총 부피의 200 마이크로리터에 추가한다. 파이펫 끝으로 튜브 내용물들을 부드럽게 소용돌이시다.
1차 항체를 4도에서 하룻밤 동안 배양한 다음 PBS의 1밀리리터에서 세 번 세척합니다. 그런 다음 총 부피의 200 마이크로 리터에, 적절한 희석에 보조 항체, 알렉사 플루어 488 염소 안티 토끼를 추가합니다. 내용기를 파이펫 팁과 혼합한 후, 나일 레드, Hoechst 와 같은 염료로 조직을 실내 온도에서 60분 동안 PBS20 마이크로리터로 배양한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.
피펫으로 100% 글리세롤의 200마이크로리터를 추가하고, 연약한 브러시를 사용하여 현미경 슬라이드당 부착된 땀샘과 내부 구조로 최대 20개의 염색된 헤드를 전달하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 헤드 샘플을 펴서 유리 슬라이드를 따라 고르게 분배합니다. 해부 현미경으로 보고, 조심스럽게 반대 방향으로 두 조직을 당겨 서 두 쌍의 포셉을 사용하여, 땀샘에서 애벌레 머리를 분리합니다.
모든 샘플이 완료되면 1.5mm 두께의 커버 슬립을 슬라이드 위에 부드럽게 놓고 기포가 형성되는 것을 피한 다음 명확한 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오. 타액선은 4단계 애벌레에서 해부하기 가 비교적 쉽습니다. 남성과 여성 애벌레는 여성의 등쪽 흉부를 따라 빨간색 줄무늬로 늦은 L4 애벌레 단계에서 구별 될 수 있습니다.
안테나 형태는 또한 더 정교하다, 여성 L4 애벌레에서보다 남성에서 볼 수 있듯이, 흰색 화살표를 지적, 왼쪽 이미지에 여성 안테나, 오른쪽에 남성 안테나. 초기 L4 단계 애벌레에서 분리 된 타액 선은 Hoechst로 얼룩진 좁은 수축으로 분리 된 근위와 황실 을 드러냅니다. 형성 루멘은 중후반 L4 애벌레의 면역 염색 된 황실 타액 선에서 검사되었습니다.
분비 세포의 정색 영역, 형성 lumen을 둘러싼 강렬한 나일 붉은 얼룩을 했다, 구조 처럼 마이크로 빌리의 암시. Rab 11 염색은 근면, 정색 표면에 가깝게 관찰되었다. 시간이 지나면 한 걸음밖에 되지 않으며, 차가운 아세톤에 있는 조직의 90초 인큐베이션입니다.
이 프로토콜은 최근에 개발되었지만 모기 침선에서 일하는 사람에게 도움이 될 것으로 기대합니다. 우리는 완전히 자주 사용할 것으로 예상.
