Die Speicheldrüsen von Insekten sind für die Übertragung vieler menschlicher Krankheiten erforderlich. Ein besseres Verständnis der Gehaltsdrüsenbiologie sollte uns also helfen, bestehende Strategien zur Krankheitsprävention zu ergänzen. Diese Technik wird es uns ermöglichen, schnell zu fragen, ob Mutationen in den Kandidatenregulatoren die Morphologie der Speicheldrüsen der Mückenlarven beeinflussen und möglicherweise die Übertragung von Malariaparasiten beeinflussen.
Die ersten Male, wenn Sie mit den Mückenlarven arbeiten, sind sie schwer zu greifen, da sie sich schnell bewegen. Je mehr du übst, desto besser wirst du. Beginnend mit dem Verfahren wird Marisol Luchetti, eine studentische wissenschaftliche Mitarbeiterin für mein Labor, sein.
Um das Experiment zu starten, legen Sie eine Töpfchenplatte auf die Bühne eines Seziermikroskops und übertragen Sie 10 Mücken-L4-Larven auf die Töpfchenplatte. Dann legen Sie einen Tropfen der Dissektionslösung auf die Töpfchenplatte getrennt von den Larven. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine L4-Larve in den Dissektionslösungstropfen von 25% Ethanol zu legen.
Indem Sie eine Nummer fünf Pinzette in jeder Hand halten, greifen Sie die Larven mit einer Pinzette direkt unter dem Kopf mit der dominanten Hand und greifen Sie den Kopf der Larve mit der nicht dominanten Hand, dann ziehen Sie den Kopf vorsichtig mit minimaler konstanter Kraft, um sich vom Rest des Körpers zu lösen, während die Drüsen am Kopf befestigt bleiben. Nachdem Sie den Körperteil des Larvenkadavers verworfen haben, sammeln Sie die Kopf- oder Speicheldrüsen in einem Milliliter PBS in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen und warten Sie, bis die Speicheldrüsen auf den Boden des Puffers sinken. Am nächsten Tag die Lösung abtropfen lassen, um das Gewebe zu fixieren, mit einem Milliliter kaltem 100% Aceton für 90 Sekunden.
Nachdem Sie das Aceton entfernt haben, spülen Sie das Gewebe dreimal vorsichtig mit einem Milliliter PBS ab. Zur Immunfärbung wird ein primärer Antikörper wie Rab 11 in der entsprechenden Verdünnung in 200 Mikrolitern des Gesamtvolumens von PBS hinzugefügt. Den Röhrcheninhalt vorsichtig mit einer Pipettenspitze schwenken.
Inkubieren Sie die primären Antikörper über Nacht bei vier Grad, gefolgt von dreimaligem Waschen in einem Milliliter PBS. Dann fügen Sie den sekundären Antikörper, Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit, in der entsprechenden Verdünnung in 200 Mikroliter Gesamtvolumen hinzu. Nachdem Sie den Inhalt mit einer Pipettenspitze gemischt haben, inkubieren Sie die Gewebe mit Farbstoffen wie Nilrot und Hoechst in 200 Mikroliter PBS bei Raumtemperatur für 60 Minuten, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBS.
Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 200 Mikroliter 100% Glycerin mit einer Pipette hinzufügen und bis zu 20 gefärbte Köpfe mit den angebrachten Drüsen und inneren Strukturen pro Objektträger mit einem weichen Pinsel übertragen. Verteilen Sie die Kopfproben, um sie gleichmäßig entlang des Glasobjektträgers zu verteilen. Wenn Sie unter einem Seziermikroskop den Larvenkopf mit zwei Pinzettenpaaren von den Drüsen trennen, indem Sie die beiden Gewebe vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
Wenn alle Proben fertig sind, legen Sie vorsichtig einen 1,5 Millimeter dicken Deckschlicker auf den Objektträger, vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, und versiegeln Sie den Objektträger dann mit klarem Nagellack. Die Speicheldrüsen sind relativ leicht zu sezieren, von Larven im vierten Stadium. Männliche und weibliche Larven können im späten L4-Larvenstadium durch einen roten Streifen entlang des dorsalen Thorax der Weibchen unterschieden werden.
Die Antennenmorphologie ist auch ausgefeilter, bei Männchen als bei weiblichen L4-Larven, wie man sehen kann, mit den weißen Pfeilen, die darauf zeigen, den weiblichen Antennen auf dem linken Bild und den männlichen Antennen auf der rechten Seite. Die Speicheldrüsen, die aus Larven im frühen L4-Stadium isoliert und mit Hoechst gefärbt sind, zeigen die proximalen und distalen Lappen, die durch eine enge Verengung getrennt sind. Das sich bildende Lumen wurde in der immungefärbten distalen Speicheldrüse einer mittleren bis späten L4-Larve untersucht.
Die apikalen Domänen der sekretorischen Zellen, die das sich bildende Lumen umgeben, wiesen eine intensive Nilrotfärbung auf, die auf mikrovilliartige Strukturen hindeutet. Die Rab-11-Färbung wurde in der Nähe der apikalen Oberfläche beobachtet. Es gibt nur einen Schritt mit der Zeit, und das ist die 90-sekunden-Inkubation, der Gewebe in kaltem Aceton.
Dieses Protokoll wurde erst kürzlich entwickelt, aber wir erwarten, dass es für jeden, der an der Mückenspeicheldrüse arbeitet, hilfreich sein wird. Wir gehen davon aus, dass wir es oft verwenden werden.
