Las glándulas salivales de los insectos, son necesarias para la transmisión de muchas enfermedades humanas. Por lo tanto, una mejor comprensión de la biología de la glándula salarial debería ayudarnos, a sumarnos a las estrategias existentes para la prevención de enfermedades. Esta técnica nos permitirá, para preguntarnos rápidamente si las mutaciones en los reguladores candidatos, afectan a la morfología, de las glándulas salivales larvales del mosquito, y potencialmente afectan la transmisión, de los parásitos de la malaria.
Las primeras veces que trabajas con las larvas de mosquitos, son difíciles de agarrar ya que se mueven rápidamente. Cuanto más practiques, mejor te pondrás. Comenzando con el procedimiento, estará Marisol Luchetti, una asistente de investigación de pregrado para mi laboratorio.
Para comenzar el experimento, coloque una placa para ir al baño en el escenario de un microscopio de disección y transfiera 10 larvas de mosquito L4 a la placa para ir al baño. Luego coloque una gota de la solución de disección, sobre la placa para ir al baño separada de las larvas. Use fórceps para colocar una larva L4, en la gota de solución de disección de etanol al 25%.
Sosteniendo un número cinco fórceps en cada mano, agarre las larvas con fórceps justo debajo de la cabeza, con la mano dominante, y agarre la cabeza de la larva con la mano no dominante, luego tire suavemente de la cabeza con una fuerza constante mínima, para separarse del resto del cuerpo, mientras que las glándulas permanecen unidas a la cabeza. Después de desechar la porción corporal de la carcasa de la larva, recoja la cabeza o las glándulas salivales, en un mililitro de PBS, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y espere a que las glándulas salivales se hundan en el fondo del tampón. Al día siguiente, escurrir la solución para fijar los tejidos, con un mililitro de acetona 100% fría durante 90 segundos.
Después de quitar la acetona, enjuague suavemente los tejidos tres veces, con un mililitro de PBS. Para la inmunotinción, agregue un anticuerpo primario como Rab 11, en la dilución adecuada, en 200 microlitros del volumen total de PBS. Gire el contenido del tubo suavemente con una punta de pipeta.
Incubar los anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados, seguido de lavar tres veces en un mililitro de PBS. Luego agregue el anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, en la dilución adecuada, en 200 microlitros de volumen total. Después de mezclar el contenido con una punta de pipeta, incube los tejidos con tintes, como el rojo del Nilo y Hoechst en 200 microlitros de PBS, a temperatura ambiente durante 60 minutos, seguido de lavar tres veces con PBS.
Prepare un portaobjetos de microscopio, agregando 200 microlitros de 100% glicerol con una pipeta, y transfiriendo hasta 20 cabezas teñidas, con las glándulas y estructuras internas adjuntas, por portaobjetos de microscopio usando un cepillo suave. Extienda las muestras de cabeza, para distribuirlas uniformemente a lo largo del portaobjetos de vidrio. Viendo bajo un microscopio de disección, separe la cabeza larval de las glándulas, usando dos pares de fórceps, tirando cuidadosamente de los dos tejidos en direcciones opuestas.
Cuando todas las muestras estén hechas, coloque suavemente un deslizamiento de cubierta de 1,5 milímetros de grosor, en la parte superior de la diapositiva, evitando la formación de burbujas de aire, y luego selle la diapositiva con esmalte de uñas transparente. Las glándulas salivales son relativamente fáciles de diseccionar, desde las larvas en etapa cuatro. Las larvas masculinas y femeninas se pueden distinguir, en la etapa larvaria L4 tardía por una franja roja, a lo largo del tórax dorsal de las hembras.
La morfología antenal también es más elaborada, en machos que en larvas L4 hembras como se puede ver, con las flechas blancas apuntando, las antenas femeninas en la imagen izquierda y las antenas masculinas a la derecha. Las glándulas salivales aisladas de larvas tempranas en etapa L4, teñidas con Hoechst revelan los lóbulos proximal y distal, separados por una estrecha constricción. Se examinó la luz formadora, en la glándula salival distal inmunomanteñida, de una larva L4 de mediados a finales.
Los dominios apicales de las células secretoras, que rodean la luz en formación, tenían una intensa tinción roja del Nilo, lo que sugiere estructuras similares a las microvellosidades. La tinción de Rab 11 se observó cerca, a la superficie apical. Solo hay un paso con el tiempo, y ese es la incubación de 90 segundos, de los tejidos en acetona fría.
Este protocolo se desarrolló recientemente, pero esperamos que sea útil para cualquiera que trabaje en la glándula salival del mosquito. Esperamos usarlo a menudo.
