P01CA040035 (FE / JAS) ve VA Kariyer Geliştirme Ödülü (JAS): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarından kabul.

1. Hücre Bakım <ol><li> MDA-MB-231 çoğu kemik metastazı yola çıkılarak alt klonlar kemik kolonizasyon ve büyüme için değişken eğilime sahip oldukları mevcut. Bizim deneyler için biz UTHSCA 2 geliştirilen GFP etiketli MDA-MB-231 türetilmiş bir klonu kullanın. Bu belirli bir alt-klon 4 hafta özveri ile, yaklaşık 3 hafta sonrası aşılama görülebilir osteolitik kemik lezyonları oluşturacaktır. </li><li> DMEM,% 5-8, 2 7 CO içinde 37 ° C &#39;de% 10 FBS, 0.1 mg / ml penisilin-streptomisin içeren hücreler koruyun. </li><li> 1:10 dilüsyon% 80-90 izdiham ve re-plaka Passage hücreler (bu hücre tipi ve boyut plaka bağlı olarak değişir. T-75 MDA-MB-231 hücre için bu yaklaşık 6x10 5&#39;tir), hangi Yaklaşık her 72 saat. </li><li> MDA-MB-231 hücrelerinde çok sayıda pseudopodia ile genel fibroblastik görünümünü korumak. Herhangi bir yuvarlama aşırı kalabalık veya diğer istenmeyen gerilme göstergesi olup, bu kaçınılmalıdırin vivo metastatik potansiyel etkileyebilir. </li><li> İdeal olarak, hücreler inokülasyon (biz az 1 wk tavsiye ya da deney için yeterli hücre elde edene kadar) daha önce sadece kısaca kültür tutulmalı ve yuvarlama veya hücre büyüme oranı değişikliği oluşursa, yeni bir flakon çözdürülmelidir. </li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> % 0.15 ile% 80-90 izdiham hücreleri Trypsinize tripsin / EDTA (PBS içinde% 0.5 Gibco Tripsin EDTA 01:02 sulandırmak). Bu konsantrasyon hızlı ayrılma (&lt;2 dakika) için olanak sağlar ve hücre kümelenmesi azaltır. </li><li> Hemen 10 ml buz-soğuk DMEM, 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de 15 ml konik santrifüj tüpü içine ve% 10 FBS, pipet ile levha içeren hücreleri çıkarmak. </li><li> 25 ml buz gibi soğuk PBS (Ca ve Mg olmadan) ve sayma içinde bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde süspanse pelet. </li><li> Yeniden pelet Santrifüj ve ml (intrakardiyak) başına 10 6 hücre ya da buz gibi soğuk PBS 250.000 cells/10 ul (intratibial) de tekrar süspansiyon haline getirin. TemperaPBS Ture hücreleri ve enjeksiyon sonrası sonraki emboli Topaklanmaması için önemlidir. Hücre süspansiyonu enjeksiyon yaparken buz üzerinde kalmalıdır ve yaşayabilir olması ve 30 dakika için un-clumped kalacaktır. Gerekli plaka sayısını tam araştırmacıdan araştırmacıya değişir iken, biz genellikle 8-10 fareler arasında 1 T-75 kullanın. </li></ol> 3. İntrakardiyak Aşılama <ol><li> 4-6 haftalık dişi (Foxn nu-/ -: Harlan) da olabilir diğer immün yetmezlikli farelerde (- -, RAG2-/, SCID, XID, vb RAG1-/) ama fareler, bu deneyler için kullanılır insan kanser hücre deneyleri ile birlikte kullanılabilir. </li><li> Enjeksiyon prosedürü gelen mortaliteyi azaltmak ve görüntüleme işlemleri arka plan floresan azaltmak için enjeksiyon öncesinde çıplak farelerin beslenen Teklad 2920x diyet 5-10 gün olmalıdır (gıda yonca ücretsiz olduğundan). </li><li> Nu / nu dışında fare kullanıyorsanız, ventral abdominal ar tıraş veya Nair (bizim deneyim Nair iyi çalışır olarak) kullanarak tüyleriyordamına başlamadan önce ea. </li><li> Veya diğer tercih edilen anestezi (bizim deneyim izofluran intrakardiyak aşılar için tolere iyi): Bir izofluran buharlaştırıcı (2-3 L / dk O 2% 2.5 Iso) kullanarak bir izolasyon odasında fare uyuştur. </li><li> Bir paslanmaz çelik havalandırılmış kaput içinde anestezi makinenin burun konisi bir defada bir fareyi hareket ettirin. </li><li> Göğüs yukarı bakacak sırtında her fare yerleştirin. </li><li> 2 kez yinelenen,% 70 etanol ardından% 10 povidon / iyot swab / çözeltisi ile göğüs yıkayın. </li><li> Enjeksiyon için Mark Farenin göğüs (steril bir kalem kullanarak veya enjeksiyon yerinde steril tutmak için biraz yana işaretleme). Biz sternumun bir işareti konumu sternal çentik ve xyphoid sürecinin üst arasında tam orta ve hafif sola (anatomik) kullanın. 300 ul 28 g ½ insülin şırınga pistonu ve menisküs arasındaki boşluk (kardiyak nabız görmek için önemli) oluşturmak için şırınga içine küçük bir hava kabarcığı çizin vehücrelerinin 100 ul hazırlar. </li><li> Dik iğne tutun. Diğer elinizle gergin fare deri tutarken, iğne takın. </li><li> Sol kalp ventrikül içine Başarılı ekleme şırınga kan farklı bir parlak kırmızı darbe ile sonuçlanmalıdır. Bu derinlikte, dikkatle göğüs boşluğuna kalp veya dökülmesini hücreleri delinmesiyle önlemek için iğne önemli hareketi olmadan, şırınganın pistonu (100 ul hacim) basın. </li><li> Hücreleri enjekte edildikten sonra, göğüs boşluğu içine hücre damlama azaltmak için negatif bir basınç yaratmak için az miktarda dalma pistonu üzerine hafifçe yukarı çekmek. </li><li> Kalp zarının yırtılmasına ve kanamaya neden olabilir kaldırma sırasında eğilme iğne önlemek için emin olurken doğrudan göğüs iğne çekin. </li><li> Kanamayı azaltmak için enjeksiyon sitesi üzerinden göğsüne hafif basınç uygulayın. </li><li> Burun konisi gelen fareyi çıkarın ve yaklaşık 1 dakika boyunca hafif bir baskı uygulamaya devam ediyoruz. </li><li> Tam con kadar ısıtma pedi için fareyi hareket ettirinscious. </li><li> Fare spin veya kurtarma sonra seğirme başlarsa, olası nedeni, bir emboli. Damar direnci azaltırken kan akımı ve kardiyak outputu artırır ketamin 80-120 mg / kg intraperitoneal yolla fare enjekte. Bu fare pıhtı geçmek yardımcı olmalıdır. Bu oluşur, sonra bu hücreler topaklanma olduğunu gösterir gibi, bu, hücre hazırlıkları değiştirmek en iyisidir. Biz yaklaşık 8 fareler sonrası hücre preparatları değiştirmek veya 30 dk. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Buprenex (0.1 mg / kg) ya da hemen işlem öncesinde benzer onaylanmış analjezik ile fare enjekte. </li><li> Izofluran kullanarak fare uyuştur, sonra burun konisi taşımak ve anesteziyi idame ettirmek. </li><li> % 10 povidon / iyot ile iki bacak temizleyin çubukla / çözüm, 2 kez tekrarlayarak, etanol izledi. Önce kürk varsa temizlik için tüylerini ayakları (Nair veya benzer ürün ile). </li><li> Yavaşça lateral malleol, medial malleol ve işaret parmağı ve inci ile tibia alt yarısında kavramakumb, sonra dirsek bacak (diz görünür ve erişilebilir şekilde fleksiyon ve lateral rotasyon kombinasyonu. </li><li> Ayrı, kalın, beyaz bir çizgi olarak görünür olmalıdır patellar ligaman, altta yatan görünürlüğünü artırmak için% 70 EtOH ile cildi ıslatın. Sıkıca 28g fare insert ½ iğne patellanın altında patellar bağ ortasından ayak bileği / bacak kavrama ve tibia üst anterior interkondiler alana da. </li><li> Tibia içine iğne takarken, hafif delme işlemi ile sürekli, sert basınç kullanarak büyüme plağı dikkatle rehberlik. </li><li> Tibial büyüme plağının penetrasyonu üzerine, iğne ile daha az direnç karşılaşacak. </li><li> Iğne tibia ve büyüme plağı geçer sağlamak için iğne yumuşak, yanal hareket kullanın. İğne tibia içinde uygun bir yer olup olmadığını Hareketi sınırlı olacaktır. </li><li> Yavaşça hücre çözümü 10 ul enjekte pistonu bastırın. Hiçbir direniş Little bu noktada hissettim olmalıdır. </li><li> SloWLY iğne ayıklayın. </li><li> Aynı prosedür izlenerek, PBS 10 ml enjekte yanındaki bacağa geçin. </li><li> Anesteziden fareyi çıkarın ve düzelene kadar ısıtma yastığı tutmak. </li><li> Sonraki 24 saat boyunca farelere Monitör ve hayvanların sıkıntı belirtileri göstermeye devam ederse ek buprenex ile her 12 saat enjekte. </li></ol> 5. Görüntüleme Zaman Kursu <ol><li> Lusiferaz Görüntüleme: Uygulanamaz, lusiferaz görüntüleme 7 gün sonrasında tümör hücre aşılama (çoğu kemik metastazı model olsa da, yakın günü 14 saptanabilir) başlayan kullanılmalıdır nerede. Fare 150 mg / kg luciferase, anestezi ile intraperitoneal ve IVIS ekipmanlar 8 kullanarak enjeksiyondan sonra 8 dakika olarak görüntülenir. </li><li> GFP görüntüleme: Genellikle GFP ifade tümörler Maestro görüntüleme ekipmanı (CRi) 9 kullanarak intrakardiyak deneyler için intratibial enjeksiyonları ve 16-21 için günde 10-14 etrafında algılanabilir olmaya başlar. Kısaca, fareler izofluran ile anestezi uygulanmıştır (% 3) Ve Maestro görüntüleme odasında bir burun konisi ile anestezi altında yapılmaktadır. Bizim eGFP salgılayan hücrelerin için biz 10 nm adımlarla 500 ms maruziyet de mavi filtre seti (eGFP için 498 excitation/515 emisyon) kullanın. </li><li> Faxitron (X-ray): X-ışınları haftalık 14 günlük 7 arasında başlayan alınır. Lezyonlar 21. günde intrakardiyak modelinde görünür ve bir hafta önce intratibial enjeksiyonları 3 olacaktır. Ex vivo ve in vivo Bizim radyografik veriler maruziyet 8 saniye için 35 kV bir Faxitron LX-60 ile elde edilmiştir. </li><li> Diğer Görüntüleme: Görüntüleme yöntemleri tamamen özel araştırma dayalı olacaktır. Yukarıdaki yöntemlere ek olarak, 3D mikro-bilgisayarlı tomografi (μCT), mikro-pozitron emisyon tomografisi (μPET), ve diğer modaliteler 10,11 dayalı canlı hayvan görüntüleme değerli bilgiler sağlayabilir. </li></ol> 6. Fare Kurban <ol><li> Her model biraz farklı bir zaman süreci vardır. MDA-MB-2 ile birlikte31 hücreleri fareler genellikle 21 ve 35 gün ve genellikle günde yaklaşık 28 (BT 21-28 gün arasında farelere enjekte) arasındaki kaşektik veya felçli hale gelir. </li><li> Bir kez birkaç fare kortikal kemik kırmaya felçli olmak, ya da vücut ağırlığının% 10-20 arasında, servikal dislokasyon (veya diğer IACUC onaylanmış yöntem) ile xylazine / ketamine doz kullanılarak çalışmadaki bütün fareler kurban kaybetmeye başlar lezyonlar gelişir. </li><li> Tamponlu% 4 formalin daha fazla çalışma ve mağaza için gerekli kemikleri çıkarın. </li><li> Göğüs tümörü olan Fare cevapsız enjeksiyon bir işareti ve çalışma dışında tutulmalıdır. </li></ol> 7. Ex Vivo Analizi <ol><li> μCT:% 70 EtOH içinde tarama kemik aynı numune üzerinde ölçülür için yapısal ve histolojik parametreler için olanak sağlar. </li><li> Kontur ve bireysel deney tasarımı ve ekipmanları mevcut 10&#39;a göre analiz. Bizim verilerimiz 12 mcM çözünürlük kullanarak Scanco μCT 40 ile elde edilmiştir. </li><li> Histomorphometry: Tercih histolojik yöntemler kullanılarak Süreç örnekleri ve Hematoksilen / Eosin 7 ile lekesi </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Tümör hücrelerinin intrakardiyak veya intratibial aşılama (Şekil 1) takiben fareler röntgen ve flöresanlı (ya da lüminesans) ile haftada bir izlenir. Onlar modeli (Şekil 2) bağlı olarak, haftada 2 gibi erken floresans ve lüminesans görülebilir iken Lezyonlar normalde haftada 2 ve 3 arasında x-ray tarafından anlaşılacaktır. Lezyonlar kemik karanlık delikler gibi görünür, ve zaman (Şekil 3) ile daha belirgin hale gelir. Lezyonlar radyografiler Metamorph analizi kullanılarak ölçüldü ve floresan Maestro (CRi) görüntüleme toplama ve analiz yazılımı kullanılarak ölçüldü. Lezyonlar büyümeye başlaması, fareler sıkça kaşektik olur. Farelerin başlangıç ​​vücut ağırlığının% 10-20 arasında bir kayıp olduğunda Kurban gereklidir. Durumu<html> farelerin hızla değiştirebilir ve gün boyunca birden çok kez kontrol edilmelidir. 3-4 hafta arası farelerde bir veya arka bacaklarda hem sürüklemeye başladığını ve tüm çalışma kurban edildi. Görüntüleri feda öncesinde alınmıştır. Anestezi overdose sonra kan kemik döngüsü veya diğer faktörler belirteçleri ölçmek için toplandı. Servikal dislokasyon sonra, cilt eksize fare ve kemiklerinden sıyrılmış ve en az 7 gün önce in vivo görüntüleme teknikleri daha tümör odaklarının görüntülenmesine izin verecektir ex vivo görüntüleme (Şekil 3) için temizlenmiş. Bir kez görüntüleme tamamlanan kemiklerde etiketli kasetleri yerleştirilir ve fiksasyon ve ileri histolojik işleme veya μCT analizi için formalin bekletildi. ΜCT kemik bozulumu miktarı (Şekil 4) ölçmek için bir incik kemiği üzerinde yapıldı sonra histomorfometri tümör yükü ve BV / TV gösteren numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Enjeksiyon doğru yerleştirilmesi. Ventral radyografik görünümü (A) 4. interkostal ve intrakardiyak aşılama için sol ventrikül içine iğne doğru yerleştirilmesi gösteren erişkin fare toraks. Anatomik görülecek sternum (beyaz özetlenen) yatay kesikli çizgi ile gösterilmiştir. Fare derisi üzerinde sternal çentik ve xyphoid süreci simgesel olarak hizmet ve iğne sternum sol biraz eklenir. Ventral radyografik görünümü (B) kondiller arasındaki hizalanır, proksimal tibia iğnenin doğru yerleştirilmesi gösteren erişkin fareden bacak. Yanal bir perspektiften bakıldığında iğne ucu tibia tuberositas ve epifiz plaka derin arkasına yerleştirilir. Enjeksiyon için ideal bir konuma beyaz bir daire ile gösterilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Şekil 2. Kemik metastazı modellerin Zaman elbette. Ca ilerlemesincer indüklediği kemik hastalığı x-ışınları ve GFP ile gösterilen + tümörlerin floresan görüntüleri intratibial enjeksiyonları (A) ve intrakardiyak enjeksiyon (B) in vivo. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Şekil 3,. . MDA-MB-231 intrakardiak gün sonra 0, 14, 21, ve 28 de GFP floresan gösteren ex vivo İmaj: intrakardiyak MDA-MB-231 modelinin Top Row Zaman elbette. Günde 14 tümör odakları yumuşak doku çıkarıldıktan sonra ex vivo sadece görünür olduğunu unutmayın. Alt satır: osteolitik kemik lezyonlar gösteren aynı femurların ex vivo radyografik görüntüler. Kemik yıkımı 3 hafta kardiyak enjeksiyonu kadar sonra genellikle görünür değildir unutmayın. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Şekil 4. Tibi ve Maestro görüntüleme ex vivo tarafından görüntülenmiştir gibi kemik metastatik hastalık. GFP Niceleme + tümörolmayan bir tümörlü fare (A) ve 4 hafta MDA-MB-231 subclone (B) GFP ifade eden bir intrakardiak sonra, bir fare ae. Tümör odakları Faxitron (D) tarafından gösterildiği gibi kemik yıkım alanları ile ilişkili tümör (C) olmadan bir kemik karşılaştırıldı. MikroBT ölçümlerden Kemik yapısal ve mineral verilerin sağlıklı bir kemik (E) ve tümörlü kemik (F) kemik yıkım alanları void alanı olarak gösterilmiştir 3d görüntü olarak işlenir. Daha sonra kemik ve tümör ayrıntılı karşılık H &amp; E ile boyanmış histolojik kesitler (G &amp; H) görülür.

<ol>
	<li>Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+biology+of+bone+metastasis:+how+the+skeleton+affects+tumor+behavior.">Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior.</a> Bone. 48, 6-15 (2011).</li><li>Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteolytic+bone+metastasis+in+breast+cancer.">Osteolytic bone metastasis in breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).</li><li>Johnson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+promotion+of+Gli2-induced+expression+of+parathyroid+hormone-related+protein,+an+important+osteolytic+factor+in+bone+metastasis,+is+independent+of+canonical+Hedgehog+signaling.">TGF-beta promotion of Gli2-induced expression of parathyroid hormone-related protein, an important osteolytic factor in bone metastasis, is independent of canonical Hedgehog signaling.</a> Cancer Res. 71, 822-831 (2011).</li><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic/Osteolytic+Bone+Lesions.">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lesions.</a> Mol. Cancer Res. , (2012).</li><li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma.">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li><li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone.">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li><li>Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hedgehog+signaling+molecule+Gli2+induces+parathyroid+hormone-related+peptide+expression+and+osteolysis+in+metastatic+human+breast+cancer+cells.">The hedgehog signaling molecule Gli2 induces parathyroid hormone-related peptide expression and osteolysis in metastatic human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 66, 7548-7553 (2006).</li><li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors.">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20, 701-714 (2011).</li><li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+myeloma+in+skeleton+of+mice+by+whole-body+optical+fluorescence+imaging.">Detection of myeloma in skeleton of mice by whole-body optical fluorescence imaging.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1701-1708 (2007).</li><li>Johnson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+live+animal+micro-CT+allows+for+quantitative+analysis+of+tumor-induced+bone+destruction.">Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction.</a> Bone. 48, 141-151 (2011).</li><li>Sterling, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Techniques for the Detection and Examination of Breast Cancer Metastasis to Bone. 46, (2011).</li><li>Steinbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo,+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice.">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease.">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tümör kaynaklı kemik hastalığı Çalışmaları en sık kullanılan iki intrakardiyak ve intratibial aşıları olmak üzere çeşitli hayvan modelleri üzerinde güveniyor. Birçok durumda, intrakardiyak kemik metastazı incelemek için en iyi seçenek olmakla birlikte, bu tam metastaz temsil etmez ve bu nedenle, memenin yağlı pedine ya da diğer enjeksiyon ortotopik ideal olarak, bu amaca yönelik kullanılmalıdır. Tümör hücreleri insan hücreleri kullanarak birçok çalışmada birincil sitesinden kolayca...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinin </td><td> Başlangıçta ATCC-Yerinden klonlanmış ve seçilmiş </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech A.Ş. </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas Biyolojik </td><td> F-0050a </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Orkestra şefi </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT tarayıcı </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Atimik çıplak farelerde </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> İnsülin Şırınga (300 ul, 28.5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Kaliper </td><td></td></tr><tr><td> Işınlanmış Kemirgen Diyet </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

models of bone metastasis

Kemik metastazları, meme, prostat ve akciğer gibi çeşitli maligniteler, ortak bir olay vardır. Bir kez kemik yılında kurulan, tümörler önemli morbidite ve mortalite 1 sorumludur. Bu nedenle, kemik tümörlerinin oluşturulması, büyüme ve aktivitesini kontrol eden moleküler mekanizmalarının anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Vivo modellerde birçok bu olayları incelemek üzere kurulan ve her özel yararları ve sınırlamaları vardır edilmiştir. En sık kullanılan modeli doğrudan atimik (çıplak) BalbC farelerin arteriyel kan akımı içine tümör hücrelerinin intrakardiyak inokülasyon kullanır. Bu işlem birçok farklı tümör tipleri (PC-3 prostat kanseri, akciğer kanseri ve fare meme yağ yastığı tümörleri dahil) uygulanabilir, ancak bu makalede biz, MDA-MB-231 meme kanseri modeli üzerinde durulacak. Bu modelde biz başlangıçta San Antonio 2 Dr Mundy grubu olarak elde edilen bir çok kemik seçici klon, kullanmak, hberi GFP ifade için transfekte ve bizim grup 3 ile yeniden klonlanmış gibi. Bu klon bir osteotropism oranı yüksek ve akciğer, karaciğer ya da böbrek üstü bezlerinin çok az metastazı olan bir kemik metastatik çeşididir. Intrakardiyak enjeksiyonlar en yaygın olarak, belli durumlarda kemik metastazı 2 çalışmaları için kullanılsa da 4 intratibial ya da memenin yağlı pedine enjeksiyon daha uygundur. , Kemik tutuklamak hayatta kalmak, çoğalırlar ve kanser-kaynaklı kemik hastalığı haline tümörler kurmak için, özellikle kanser hücrelerinin metastaz yeteneği daha sonraki aşamalarında izleme amacı ile, insan tümör hücrelerinde kullanıldığında kalp içi enjeksiyon tipik olarak gerçekleştirilir. Bir tümör saptandığında metastatik kemik hastalığını kabaca ilişkilidir kemik, metastas sonra kanser hücreleri ve kemik ilişkisi üzerinde duruluyor varsa Intratibial enjeksiyonlar yapılır. Emboli ve giriş için ne bu modellerin recapitulates metastatik süreci erken adım öncekidolaşıma tümör hücrelerini yok etmektedir. Kemik birincil sitesinden primer tümörün büyümesi veya metastaz izlenmesi, sonra memenin yağlı pedine aşılar genellikle tercih olmakla birlikte, çok az sayıda tümör hücre hatları sürekli, 4T1 kemik tercihli klonları ile, birincil sitesinden kemik, meme fare metastaz olur karsinom, istisna 5,6 olmak. Bu yazının ayrıntıları aşılama işlemleri ve sonrası aşılama analizlerde golleri önemli adımlar. Özellikle, hücre kültürü, intrakardiyak ve intratibial aşılar için tümör hücre aşılama işlemleri yanı sıra, röntgen, floresans ve histomorfometrik analizleri ile haftalık izleme ile ilgili özet bilgiler içerir.

Watch this Scientific Journal Video about Models of Bone Metastasis at JoVE.com

Models of Bone Metastasis

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik Metastaz Modelleri

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Research

JoVE Journal

Medicine

41.9K Görüntüleme.  Vanderbilt University. Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Video: Models of Bone Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Deneysel metastaz Testi

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Tıp

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

Ayarlanabilir Sertlik, Sıçan Femur Osteotomi ve Segmental Kemik Hata Modelleri için Eksternal Fiksatör

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Fare Servikal lenf nodu Yüksek frekanslı Ultrasonik Görüntüleme

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Bir &quot;Hasta gibi&quot; Ortotopik singenik Fare Modeli Hepatoselüler karsinomu metastazı

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

İçi periton Yumurtalık Kanseri Metastaz kantitasyonu

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...