Bağırsak bakterileri, böcek konakçılarının çoklu fizyolojik süreçlerini etkileyebilir. Aksenik larvaların hazırlanması ve sürdürülmesi, bağırsak bakteri fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokolün başlıca avantajları, yüzey sterilize edilmiş yumurtalardan elde edilen arka aksenik yaprak yiyen böceklere mikropsuz yapraklar elde etmek için bitki doku kültürünün kullanılması ve bu yöntemin yapay diyetlerle kısıtlanmamasıdır.
Bu yöntem uygundur ve gelecekteki bağırsak bakteri çalışmaları için, özellikle de iyi gelişmiş yapay diyetleri olmayan model olmayan böcekler için aksenik böceklerin korunmasının görünürlüğünü arttırır. P.versicolora popülasyonunu bir büyüme odasında 27 santigrat derece ve% 70 bağıl nemde, 16 saatlik bir ışık ve sekiz saatlik karanlık fotoperiyotta tutun. Böcekleri eğilmiş ıslak emici kağıtla delikli plastik kutulara yerleştirin ve taze kavak dallarıyla besleyin.
Nemi korumak için emici kağıda temiz su püskürtün ve dalları her iki günde bir değiştirin. Yetişkinleri yavrulamadan sonra yumurtlama için izole edin ve daha fazla yumurta elde etmek için yumuşak yapraklarla besleyin. 24 saat içinde, yeni serilmiş yumurtaları toplayın ve aksenik larvaları hazırlamak için 60 saat boyunca nemli emici kağıda yerleştirin.
MS ortamını mililitre alfa-naftalin asetik asit veya NAA stok çözeltileri başına bir miligramda hazırlayın. Bir biyogüvenlik başlığında, 500 mililitre MS ortamına 50 mikrolitre NAA stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırmak için çalkalayın. Daha sonra doku kültürü kabı başına yaklaşık 50 mililitre dökün ve katılaşma için bekleyin.
Neşterleri ve forsepsleri biyogüvenlik başlığındaki bir alkol lambası alevinde sterilize edin. Yaklaşık bir aylık büyümede kavak fidelerinden apikal tomurcuklar veya yanal tomurcuklar ile üç ila dört santimetre gövde segmentlerini kesin ve bunları kültür ortamına, kap başına bir veya iki kök segmentine yerleştirin. Bu kök segmentlerini yaklaşık 30 gün boyunca bir büyüme odasında kuluçkaya yatırın.
Ve aksenik larvaları beslemek için bu mikropsuz yaprakları kullanın. Otoklav Petri tabakları, boya fırçaları, filtre kağıdı, LB agar ortamı içeren bir Petri kabında damıtılmış su. Yapışkan yumurtalı yaprakları bir Petri kabına yerleştirin.
Daha sonra forseps kullanarak yumurtaları yapraklardan dikkatlice çıkarın ve başka bir Petri kabına aktarın. Bu yumurtaları sekiz dakika boyunca% 75 etanol ile yıkayın. Daha sonra yıkamayı steril suyla dört kez tekrarlayın.
Kuluçka için nemi korumak için yumurtaları LB agar ortamına aktarın. Petri kabını bir büyüme odasına yerleştirin ve yumurtaların 24 saat içinde yumurtadan çıkmasını bekleyin. Bir biyogüvenlik başlığında, Petri kabına üç parça ıslak filtre kağıdı döşeyin ve kağıda mikropsuz kavak yaprakları yerleştirin.
Larvaları toplayın ve yaprakların üzerine yerleştirin. Petri kabını Parafilm ile kapatın ve bir büyüme odasında kuluçkaya yatırın. Yaprakları iki günde bir değiştirin.
Geleneksel olarak yetiştirilen gruplar için, yumurtaları yapraklardan nemli filtre kağıdı içeren bir Petri kabına aktarın ve bu larvaları mikropsuz kavak yaprakları ile besleyin. Mikropsuz ve geleneksel olarak yetiştirilen gruplardan rastgele üç birinci, ikinci ve üçüncü instar larva seçin. Üçüncü instar larvalarını steril makas ve forseps ile stereo mikroskop altında inceleyin ve bağırsaklarını mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.
Tüplerde sağlam birinci ve ikinci instar larvalarını toplayın. 1,5 mililitrelik tüplere 100 mikrolitre PBS ve üç çelik bilye ekleyin ve bir boncuk çırpma homojenizatörü kullanarak dokuları homojenatlar halinde öğütün. LB agar ortamına 100 mikrolitre homojenat ekleyin ve steril bir cam serpme çubuğu kullanarak plakalayın.
Plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sonra bakteri kolonilerini gözlemleyin. Bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak daha önce elde edilen dokuların toplam DNA'sını çıkarın ve DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.
PCR ile evrensel 16S rRNA primerleri kullanarak bakteriyel 16S rRNA genini yükseltin ve metin yazısında açıklandığı gibi reaksiyonu ayarlayın. PCR ürünlerini daha fazla analize kadar dört santigrat derecede saklayın. PCR ürünlerini nükleik asit boyası ile karıştırın ve 1X TAE tamponunda% 1 agaroz jeli üzerinde elektroforez kullanarak analiz edin.
Referans olarak 10 mikrolitre DNA belirteci kullanın. Jeli bir UV transilluminator ile gözlemleyin ve hedef parçayı 1.500 baz çifti civarında arayın. Mikropsuz herhangi bir grupta bakteri kolonisi gözlenmemesine rağmen, geleneksel olarak yetiştirilen tüm gruplarda gözlenmiştir, bu da doku kültürlü kavak yaprakları ile beslenen sterilize yumurtalardan elde edilen larvaların bakteri içermediğini göstermektedir.
1.500 baz çifti PCR bandı, geleneksel olarak yetiştirilen tüm gruplarda ortaya çıktı. Buna karşılık, mikropsuz gruplarda veya negatif kontrolde hiçbir bant gözlenmedi, bu da aksenik larvalarda bağırsak bakterisinin bulunmadığını ima etti. Küçük yumurtalı böcek türleri için, dezenfektan türlerinin ve sterilizasyon süresinin optimize edilmesi gerekiyordu.
Ek olarak, doku kültürlü bitkilerde endofitler dikkate değer olmalıdır. Bu protokol, özellikle iyi gelişmiş yapay diyetleri olmayan model olmayan böcekler için böcek-bağırsak bakteri etkileşimi çalışmalarını kolaylaştırmak için kullanışlı bir araç olan mikropsuz böcekleri korumak için yeni bir yöntem sağlar.
