Bu ayrıntılı protokol, E.Coli'deki rekombinant MMP-3 katalitik alan için diğer MMP terapötik hedeflerine uygulanabilen oldukça verimli ve uygun maliyetli bir bakteri ekspresyonu yöntemini açıklamaktadır. E.coli, karmaşık bir protein katlama ve çeviri sonrası işleme sisteminden yoksundur. Bu yöntem, E.coli'de ökaryotik protein ekspresyonunu arttırmak için R2DP hücre suşunu kullanır.
Spesifik MMP'lerin aşırı üretimi kanser, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çeşitli hastalıklara yol açar. Aktif çözünür MMP'ler, terapötikleri inhibe eden MMP'lerin geliştirilmesi için gereklidir. LB ampisilin kloramfenikol dirençli bir plakadan LB ampisilin kloramfenikol dirençli plakadan 37 santigrat derecede beş mililitre LB ampisilin kloramfenikol dirençli ortamda, tek bir izole pET His-tag pro MMP-3 katalitik alan dönüştürücü kolonisini aşılayın.
Her kültürden alikotları kurtarın ve% 40 gliserol stokları hazırlayın. 500 mililitre LB ampisilin kloramfenikol dirençli ortam içeren bir litrelik şişeyi, gece kültürü ile 600 nanometrede 0.05 ila 0.1 optik yoğunluğa aşılayın. Optik yoğunluğu birkaç zaman noktasında 600 nanometrede, tipik olarak 0,4 ila 0,6 arasına düşene kadar üç ila dört saat boyunca ölçün.
Bir molar IPTG stoğu olan kültürleri bir milimolar'ın son konsantrasyonuna indükleyin. 37 derecelik çalkalayıcıda üç ila dört saat daha inkübe edin. Hücreleri 250 mililitrelik konik şişelerde 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve kültürler tamamen peletlenene kadar tekrarlayın.
Pelet gramı başına üç mililitre lizis tamponu ekleyin ve vorteks veya pipetleme ile peleti yeniden askıya alın. Bir litre kültür başına hacimce sodyum deoksikolat ağırlıkça% 10 1.25 mililitre ekleyin. Bir litre kültür başına 10 mikrolitre DNaz I ekleyin.
Oda sıcaklığında 150 RPM'de 30 dakika çalkalayın. 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj. Süper natantı atın.
Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, kaynaştırma gövdesi tamponunun litre kültürü başına 100 mililitre içinde yeniden askıya alın. Aşırı ısınmayı önlemek için sonikasyon sırasında örnekleri buz üzerinde tutun. Her numuneyi 15 saniyelik altı döngü, beş çıkış ve% 50 nabız için sonikleştirin.
Numuneleri 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Pelet'i kontrol edin. Pelet kompaktsa, süpernatanı atın.
Her peleti bir litrelik kültürden ve beş mililitre çözündürme tamponundan geri alın. Proteinlerin çözünmesini sağlamak için buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de dört santigrat derecede santrifüj yapın.
Pelet santrifüjlemeden sonra oluşursa, süpernatantı ayrı bir 50 mililitrelik konik tüpe dökün. Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, bir litre kültür başına beş mililitre daha çözünürleştirme tamponunda yeniden askıya alın. 13.000 G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüj.
Ardından, süpernatanları çekin. Pelet atın veya ek sonikasyon için eksi 80 santigrat derecede saklayın. HT yıkama tamponuna karşı boş bırakın ve ilk yıkama fraksiyonunun A280'ini kaydedin.
A280 taban çizgisine yaklaşana kadar diğer kesirlerle tekrarlayın. Beş mililitre HT elüsyon tamponu ekleyerek His etiketli proteinleri derhal süzün. HT elüsyonu etiketli mikrofüj tüplerinde 0,5 ila bir mililitre fraksiyondaki akışı toplayın.
Elüsyon fraksiyonunun A280'ini ölçün. A280, mililitre başına 0,3 miligramdan büyükse, fraksiyonu HT denge tamponu ile seyreltin. Salınımlı MMP fraksiyonlarını diyaliz tüpündeki bir litre diyaliz tamponuna batırın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın.
Bir litre diyaliz tamponu ikiye aktarın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın. Daha sonra, bir litre diyaliz tamponu üçüne aktarın ve tüpü ve içeriğini dört santigrat derecede en az sekiz saat boyunca manyetik bir karıştırma üzerinde karıştırın. Numuneyi uygun bir kaba aktarın ve çevrilmiş MMP olarak etiketleyin.
Tüpü herhangi bir çökelti için inceleyin. Mililitre MMP başına bir miligramlık bir mililitre aliquot başına, bir milimolar'ın son APMA konsantrasyonuna ulaşmak için 50 mikrolitre 20 milimolar APMA ekleyin. Bir çökelti oluşursa, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın.
Süpernatantı aktif MMP etiketli 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpünde saklayın. Çökeltiyi APMA atıkları için işaretlenmiş bir kaba atın. SDS-PAGE, R2DP hücrelerindeki BL21 DE3 hücrelerinden His-tag pro MMP-3 katalitik etki alanının His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmak için çalıştırıldı.
His-etiketli MMP katalitik etki alanının ve BL21 DE3 hücrelerinin ilk sekiz elüsyon fraksiyonu, R2DP hücrelerinde His etiketli MMP katalitik alanındakilerden daha az protein gösterdi. MMP3 CD ve R2DP hücrelerinin indüklenmiş, yeniden katlanmış, konsantre, aktive edilmiş ve tuzdan arındırılmış fraksiyonları gösterilmiştir. Aktivasyon üzerine, aktive edilen MMP-3 CD bandının moleküler ağırlığı, yaklaşık 30 kilodaltonda kalan His etiketli zimojenin aksine, yaklaşık 20 kilodaltondur.
Hücre lizatlarını santrifüj ederken, peletler kompakt olmayabilir. Bu meydana geldiğinde, daha fazla sonikasyon yapın ve daha uzun süre santrifüj yapın. Proteini yeniden yoğunlaştırırken, yağış meydana gelebilir.
Çözünürizasyon tamponunda çözün ve işlemi tekrarlayın. Burada açıklanan prosedür, sonunda MMP enzimatik aktivitesinin moleküler mekanizmasını anlamak için kullanılabilecek aktif insan MMP'lerinin çözünür ekspresyonu için ayrıntılı bir yöntem sağlar. Saflaştırılmış MMP proteinlerine FPLC gibi alternatif protein saflaştırma yöntemleri uygulanabilir.
