Protokol, ventral diensefalonda nörotoksin 6-hidroksidopaminin intraserebroventriküler enjeksiyonunu takiben zebra balığı motor bozukluğunu ve müteakip iyileşmeyi göstermede önemlidir. Bu teknik, çok basit bir kurulum kullanarak, 6-OHDA lezyonlu yetişkin zebra balıklarının ventral diensefalonundaki dopaminerjik nöronların spesifik ablasyonuna karşılık gelen fonksiyonel etkilerdeki değişiklikleri göstermektedir. Nörorejenerasyonun altında yatan mekanizmaların yanı sıra süreci modüle eden içsel ve dışsal faktörler üzerine gelecekteki çalışmalar, Parkinson hastalığına karşı hücre replasman tedavi stratejileri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Balıkları, litre ticari deniz tuzu başına bir gram ile, 28, artı veya eksi bir santigrat derece kontrol sıcaklığı altında, havalandırılmış damıtılmış mineralize bir su tankında tutun. 45 litrelik tank başına en fazla 25 balık barındırın ve bunları 14 saatlik bir ışığa ve 10 saatlik karanlık fotoperiyoda maruz bırakın. Balıkları günde en az iki kez, dondurularak kurutulmuş solucanlarla desteklenmiş yiyecek topaklarıyla besleyin.
250 mililitre damıtılmış suda iki buçuk gram Trikain metansülfonat ve beş gram sodyum bikarbonat çözerek bir Trikain metansülfonat stok çözeltisi hazırlayın. 200 mililitre çalışma anestezi çözeltisi yapmak için iki mililitre stok çözeltisini seyreltin. 99.96 milimolar 6-hidroksidopamini, ilk önce 0.2 miligram askorbik asidi, hacim steril filtrelenmiş sodyum klorür ile% 0.9 ağırlıkta% 0.9 ağırlığında çözerek taze olarak hazırlayın.
Çözeltiyi 0,2 mikron filtre ile filtreleyin. Daha sonra çözeltiye toz halinde 25 miligram 6-hidroksidopamin ekleyin. Anestezi uygulanan balıkları, stereo mikroskop altına yerleştirilmiş suya batırılmış bir sünger üzerine yerleştirin ve balıkları düzenli olarak ıslatın.
Zebra balığı beyninin parietal ve frontal kafatasını birbirine bağlayan metopik sütür, koronal sütür ve sagital sütür arasındaki kesişime dayanarak enjeksiyon pozisyonunu tanımlayın. Ardından, keskin bir 27 gauge iğne kullanarak bir milimetre karelik küçük bir delik açın. Zebra balığı kafatasının kafatası çatısından 1200 mikrometre derinliğe ulaşana kadar mikrokapiler enjektörü 60 derecelik bir açıyla indirin.
Konumu düzeltmek için Z sınırına basın. İlk enjeksiyon basıncını 4.000 hektopaskal olarak ayarlayın. 2.3 saniyede enjeksiyon süresi.
10 hektopaskal için kompanzasyon basıncı. Sonraki her enjeksiyonda enjeksiyon yoğunluğunu azaltın. Sahte kontrol grubuna 0.5 mikrolitre 99.96 milimolar nörotoksin 6-hidroksidopamin veya hacim salinine göre% 0.9 ağırlık enjekte edin ve mikrokılcal damarın 20 saniye dinlenmesine izin verin.
Kurumasını önlemek için balıkları işlem boyunca damıtılmış suyla ıslatmaya devam edin. Mikrokılcal damarı yavaşça çıkarın ve balıkları akan damıtılmış su altında yeniden canlandırın. Balıkları izole edilmiş bir kurtarma tankına yerleştirin ve kurtarma işlemini potansiyel olarak bozabilecek dikkat dağıtıcı unsurları giderin.
Bir sonraki enjeksiyondan önce mikrokapiler ile yıkayın, tıkanıklığı temizleyin ve enjeksiyon yoğunluğunun istenen 0.5 mikrolitre 6-hidroksidopamin hacmini elde etmek için yeterli olduğundan emin olun. Zebra balıklarının lokomotor değerlendirmesini ayrı ayrı, açık tank testi yoluyla, üçüncü gün ve 30. günde, 6-hidroksidopamin sonrası yapın. Duvarları beyaz kağıtla kaplı deney tankını yükseltilmiş bir platforma yerleştirin.
Bir ışık kaynağı kullanarak tankı alttan aydınlatın. Tankı% 80 ila% 90 damıtılmış suyla doldurun ve sıcaklığı 28, artı veya eksi bir santigrat derecede tutun. Bir termometre kullanarak sıcaklığı ölçün ve ticari bir akvaryum ısıtıcısı kullanarak düzenleyin.
En az iki dakikalık iklimlendirmeden sonra, beş dakika boyunca bir video kamera kullanarak, balık yüzme davranışını deney alanının iki boyutlu düzleminde planlı bir görünümden kaydedin. Tutarsızlıkları önlemek için, farklı kayıt gruplarında, 10 dakikalık iklimlendirmeyi geçmeyin. Kat edilen mesafenin ve her konunun ortalama hızının elde edilmesi için açık tank protokolüne sahip video izleme yazılımını kullanarak videoları analiz edin.
Bu deney, 6-hidroksidopamin ile intraserebroventriküler mikroenjeksiyonu takiben yetişkin zebra balığı yüzme davranışındaki değişiklikleri değerlendirdi. Ana beyin bölgesi, preoptik bölge, posterior tüberkülum ve hipotalamustan oluşan ventral diensefalondu. Ventral diensefalondaki tirozin hidroksilaz immünoreaktif dopaminerjik nöronların% 85'inden fazlası üçüncü gün postlezyonunda ablatlandı.
Tirozin hidroksilaz immünoreaktif dopaminerjenik nöronların sayısı daha sonra 30 günlük postlezyonda tam rejenerasyona ulaşmadan önce, 14. gün postlezyonunda% 50'den fazla artar. Zebra balıklarının yüzme davranışının video izleme yazılımı kullanılarak analizi, lezyonlu grubun hem ortalama hızının hem de seyahat ettiği mesafenin, üçüncü gün postlezyonunda, sahte ile karşılaştırıldığında% 45'in altına düştüğünü göstermiştir. Lezyonlu grup, 30 günlük postlezyon ile karşılaştırıldığında, ortalama hız veya kat edilen mesafe arasında anlamlı bir fark olmaksızın motor fonksiyon iyileşmesi sergiledi.
Lokomotor değerlendirmesinin sabit bir zaman dilimi içinde yapılması önemlidir. Örneğin, 08:00 - 12:00 arası. Ve su sıcaklığı deney boyunca 28 santigrat derecede tutuldu. Yetişkin zebra balığı beyninin 6-OHDA enjeksiyonunu takiben, dopaminerjik nöronların ablasyonunun ek değişikliklerini veya fonksiyonel etkilerini araştırmak için shoaling ve anksiyete benzeri davranışlar gibi diğer davranış testleri yapılabilir.
