Протокол имеет важное значение для демонстрации двигательных нарушений рыбок данио и последующего выздоровления после интрацеребровентрикулярной инъекции нейротоксина 6-гидроксидофамина в вентральный диэнцефалон. Этот метод демонстрирует изменения функциональных эффектов, которые соответствуют специфической абляции дофаминергических нейронов в вентральном диэнцефалоне 6-OHDA пораженных взрослых рыбок данио, используя очень простую установку. Будущие исследования механизмов, лежащих в основе нейрорегенерации, а также внутренних и внешних факторов, которые модулируют процесс, могут дать важную информацию о стратегиях клеточного заместительного лечения против болезни Паркинсона.
Выдерживайте рыбу в резервуаре для газированной дистиллированной минерализованной воды с одним граммом на литр коммерческой морской соли, при контрольной температуре 28, плюс-минус один градус Цельсия. Разместите максимум 25 рыб на 45-литровый аквариум и подвергайте их воздействию 14-часового света и 10-часового темного фотопериода. Кормите рыбу не реже двух раз в день пищевыми гранулами, дополненными сублимированными червями.
Готовят запасной раствор метансульфоната трикаина, растворяя два с половиной грамма трикаина метансульфоната и пять граммов бикарбоната натрия в 250 миллилитрах дистиллированной воды. Развести два миллилитра исходного раствора, чтобы получилось 200 миллилитров рабочего раствора для анестезии. Готовят 99,96 миллимолярного 6-гидроксидофамина, сначала растворяя 0,2 миллиграмма аскорбиновой кислоты в одном миллилитре весом 0,9% по объему стерильного фильтрованного хлорида натрия.
Отфильтруйте раствор с помощью 0,2-микронного фильтра. Затем добавьте в раствор 25 миллиграммов 6-гидроксидотамина в виде порошка. Поместите обезболенную рыбу на пропитанную водой губку, поместите под стереомикроскоп и регулярно смачивайте рыбу.
Определите положение для инъекции, исходя из пересечения между метопическим швом, корональным швом и сагиттальным швом, соединяющим теменный и лобный череп мозга рыбок данио. Затем сделайте небольшое отверстие в один миллиметр в квадрате, используя острую иглу 27 калибра. Опустите микрокапиллярный инжектор под углом 60 градусов, пока он не достигнет глубины 1200 микрометров от черепной крыши черепа рыбки данио.
Нажмите Z-предел, чтобы зафиксировать положение. Установите начальное давление впрыска на 4 000 гектопаскаль. Продолжительность инъекции 2,3 секунды.
Компенсация давления до 10 гектопаскалей. Снижают интенсивность инъекции, с каждой последующей инъекцией. Введите 0,5 микролитра 99,96 миллимолярного нейротоксина 6-гидроксидофамина или 0,9% веса по объемному физиологическому раствору в фиктивной контрольной группе и дайте микрокапилляру отдохнуть в течение 20 секунд.
Продолжайте смачивать рыбу дистиллированной водой на протяжении всего процесса, чтобы предотвратить высыхание. Медленно удалите микрокапилляр и реанимируйте рыбу под проточной дистиллированной водой. Поместите рыбу в изолированный резервуар для восстановления и удалите любые отвлекающие факторы, которые могут потенциально нарушить процесс восстановления.
Промыть микрокапилляр перед следующей инъекцией, чтобы очистить закупорку и убедиться, что интенсивность инъекции достаточна для получения желаемого объема в 0,5 микролитра 6-гидроксидофамина. Выполняйте локомоторную оценку рыбок данио индивидуально, с помощью теста в открытом аквариуме, на третий день и на 30-й день, после 6-гидроксидотамина. Поместите экспериментальный резервуар со стенками, покрытыми белой бумагой, на приподнятую платформу.
Осветите бак снизу, используя источник света. Наполните резервуар 80-90% дистиллированной водой и поддерживайте температуру на уровне 28, плюс-минус один градус Цельсия. Измерьте температуру с помощью термометра и регулируйте ее с помощью коммерческого аквариумного обогревателя.
После минимум двух минут акклиматизации запишите плавательное поведение рыбы с запланированного вида на двумерной плоскости экспериментальной площадки, используя видеокамеру в течение пяти минут. Во избежание несоответствий, в разных партиях записей не превышайте 10 минут акклиматизации. Анализируйте видео с помощью программного обеспечения для отслеживания видео с открытым протоколом танка, для получения пройденного расстояния и средней скорости каждого субъекта.
В настоящем эксперименте оценивались изменения в плавательном поведении взрослых рыбок данио после внутричеребровентрикулярной микроинъекции с 6-гидроксидофамином. Основной областью мозга, представляющей интерес, был вентральный диэнцефалон, состоящий из преоптической области, заднего туберкулеза и гипоталамуса. Более 85% тирозингидроксилазных иммунореактивных дофаминергических нейронов в вентральном диэнцефалоне были удалены на третий день после окончания.
Затем количество тирозингидроксилазных иммунореактивных допаманергенных нейронов увеличивается более чем на 50% на 14-й день после 14-го дня, прежде чем достичь полной регенерации через 30 дней после сеанса. Анализ плавательного поведения рыбок данио с использованием программного обеспечения для видеослежения показал, что как средняя скорость, так и расстояние, пройденное пораженной группой на третий день после высадки, были значительно снижены до менее чем 45% по сравнению с фикцией. Пораженная группа продемонстрировала восстановление двигательной функции через 30 дней после поражения, без существенной разницы ни в средней скорости, ни в пройденном расстоянии по сравнению с фиктивным.
Важно, чтобы оценка опорно-двигательного аппарата проводилась в течение фиксированного периода времени. Например, с 8:00 до 12:00. А температура воды поддерживалась на уровне 28 градусов по Цельсию, на протяжении всего эксперимента. Другие поведенческие тесты, такие как мелководье и тревожное поведение, могут быть выполнены для изучения дополнительных изменений или функциональных эффектов абляции дофаминергических нейронов после инъекции 6-OHDA в мозг взрослой рыбки данио.
