이 프로토콜은 복부 diencephalon에서 신경 독소 6-hydroxydopamine의 intratracerebroventricular 주사에 이어 제브라 피쉬 운동 장애 및 후속 회복을 입증하는 데 중요합니다. 이 기술은 매우 간단한 설정을 사용하여 6-OHDA 병변 성인 제브라 피쉬의 복부 diencephalon에서 도파민 성 뉴런의 특정 절제에 해당하는 기능적 효과의 변화를 보여줍니다. 신경 재생의 기초가되는 메커니즘과 과정을 조절하는 내재적 및 외인성 요인에 대한 미래의 연구는 파킨슨 병에 대한 세포 대체 치료 전략에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
상업용 바다 소금 리터 당 한 그램의 폭기 된 증류 된 미네랄 워터 탱크에서 28 플러스 또는 영하 섭씨 온도의 제어 온도에서 물고기를 유지하십시오. 45 리터 탱크 당 최대 25 마리의 물고기를 수용하고 14 시간의 빛과 10 시간의 어두운 광기에 노출시킵니다. 냉동 건조 웜으로 보충 된 음식 펠릿으로 하루에 두 번 이상 물고기에게 먹이를주십시오.
250 밀리리터의 증류수에 2 그램의 트리카인 메탄 설포네이트와 5 그램의 중탄산 나트륨을 용해시켜 트리카인 메탄 설포네이트 원액을 준비하십시오. 2 밀리리터의 원액을 희석하여 200 밀리리터의 작업 마취 용액을 만듭니다. 99.96 밀리몰 6-하이드록시도파민을 먼저 0.2 밀리그램의 아스코르브산을 0.9 부피%의 한 밀리리터에 용해시켜 멸균 여과된 염화나트륨을 갓 준비한다.
0.2 미크론 필터로 용액을 여과하십시오. 그런 다음 분말 형태의 6- 히드 록시 도파민 25 밀리그램을 용액에 첨가하십시오. 마취 된 물고기를 물에 담근 스폰지에 놓고 스테레오 현미경 아래에 놓고 물고기를 정기적으로 적시십시오.
제브라피쉬 뇌의 정수리 및 전두엽 두개골을 연결하는 메토픽 봉합사, 코로나 봉합사 및 시상 봉합사 사이의 교차점을 기반으로 주사 위치를 확인하십시오. 그런 다음 날카로운 27 게이지 바늘을 사용하여 한 밀리미터 제곱의 작은 구멍을 만드십시오. 제브라 피쉬 두개골의 두개골 지붕에서 1200 마이크로 미터의 깊이에 도달 할 때까지 미세 모세관 주입기를 60도 각도로 내립니다.
Z-리밋을 눌러 위치를 수정합니다. 초기 사출 압력을 4, 000 헥토파스칼로 설정하십시오. 2.3 초에서 주입 기간.
10 헥토파스칼에 대한 보상 압력. 주사의 강도를 낮추고, 각각의 후속 주사와 함께. 가짜 대조군에 99.96 밀리몰 신경독소 6-히드록시도파민 또는 0.9 부피% 중량% 식염수 0.5 마이크로리터를 주입하고 미세모세관을 20초 동안 쉬게 한다.
건조를 방지하기 위해 과정 전반에 걸쳐 증류수로 물고기를 계속 적시십시오. 천천히 미세 모세 혈관을 제거하고 흐르는 증류수에서 물고기를 소생시킵니다. 물고기를 격리 된 복구 탱크에 넣고 복구 과정을 방해 할 수있는 산만 함을 제거하십시오.
다음 주사 전에 미세모세관을 플러시하고, 막힘을 제거하고 주사의 강도가 0.5 마이크로리터의 6-히드록시도파민의 원하는 부피를 산출하기에 충분한지 확인한다. 개방 탱크 테스트를 통해 제브라 피쉬의 운동 평가를 개별적으로 수행하고 3 일째와 30 일째에 6- 히드 록시 도파민을 게시하십시오. 벽이 흰 종이로 덮인 실험 탱크를 제기 된 플랫폼에 놓습니다.
광원을 사용하여 탱크를 바닥에서 비추십시오. 탱크를 80 ~ 90 % 증류수로 채우고 온도를 섭씨 1도 플러스 또는 영하 28로 유지하십시오. 온도계를 사용하여 온도를 측정하고 상업용 수족관 히터를 사용하여 온도를 조절하십시오.
최소 두 분의 순응 후, 다섯 분 동안 비디오 카메라를 사용하여 실험 영역의 이차원 평면에 계획된 뷰에서 물고기 수영 행동을 기록하십시오. 불일치를 피하려면 서로 다른 녹음 배치에서 순응 10 분을 초과하지 마십시오. 개방형 탱크 프로토콜로 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 비디오를 분석하여 각 피사체의 이동 거리와 평균 속도를 획득하십시오.
본 실험은 6-하이드록시도파민을 사용한 뇌심실 미세주사에 이어 성인 제브라피쉬 수영 행동의 변화를 평가하였다. 관심의 주요 뇌 영역은 시전 영역, 후부 결핵 및 시상 하부로 구성된 복부 diencephalon이었다. 복부 디뇌팔론에서 티로신 하이드록실라제 면역반응성 도파민성 뉴런의 85% 이상이 병변 후 셋째 날에 절제되었다.
티로신 하이드록실라제 면역반응성 도파민제닉 뉴런의 수는 병변 후 30일 후 완전한 재생을 달성하기 전에 14일째에 50% 이상 증가한다. 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 제브라 피쉬 수영 행동을 분석 한 결과, 병변 후 세 번째 날에 병변 그룹의 평균 속도와 이동 거리가 가짜와 비교할 때 45 % 미만으로 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 병변 그룹은 30 일 후 운동 기능의 회복을 나타 냈으며, sham과 비교할 때 평균 속도 또는 이동 거리의 큰 차이는 없었습니다.
고정 된 기간 내에 운동 평가를 수행하는 것이 중요합니다. 예를 들어 오전 8:00~오후 12:00입니다. 그리고 수온은 실험 내내 섭씨 28도로 유지되었다. 떼 짓기 및 불안과 같은 행동과 같은 다른 행동 테스트를 수행하여 성인 제브라 피쉬 뇌의 6-OHDA 주사에 이어 도파민성 뉴런 절제술의 추가 변화 또는 기능적 효과를 탐구 할 수 있습니다.
